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斑马鱼养殖系统的搭建及养殖技术

第二章 斑马鱼的养殖

 

第一节  斑马鱼常规养殖条件

斑马鱼的健康养殖是开展一切斑马鱼有关的研究工作的基础。斑马鱼的实验室饲养过程中,以下的一些环境条件对于斑马鱼的存活、健康、和繁殖传代至关重要。

温度

斑马鱼是一种小型热带淡水鱼类,可以耐受比较广的温度。最大耐受的温度范围为6至38?C。一般认为28.5?C是斑马鱼养殖的最适温度,通常情况下鱼房温度控制设置在28?C。较高的养殖温度可能导致水体的溶氧度降低,且造成水体中细菌的滋生,影响斑马鱼的健康。而过低的养殖温度会造成斑马鱼的生长发育放缓,产卵量降低。

pH

水体的pH值对鱼类的生长繁殖具有重要的影响。目前,仍然缺乏系统的实验结果确定斑马鱼生长繁殖的最佳pH值。大部分斑马鱼养殖设备维持水质pH值在7.0-8.0左右,这也是大部分淡水鱼类生活的pH范围。斑马鱼相对可耐受一定的碱性环境,酸性环境,尤其pH低于6.0会造成斑马鱼死亡。

硬度

水的总硬度指水中Ca2+和Mg2+等离子的总浓度。斑马鱼适宜于较高硬度的水,水体硬度超过100mg/L CaCO3有利于斑马鱼的生长繁殖。但是,这种适应是有限的。目前,尚没有系统全面的研究不同范围的硬度条件对斑马鱼生长发育方面的影响。

盐度

斑马鱼属淡水鱼类,但是能够耐受很大的盐度范围。斑马鱼养殖的适宜盐度通常为0.25‰。养殖系统的盐度控制范围为0.25-0.75‰。

溶解氧

溶解氧是鱼类养殖中的重要条件参数。低水平的溶解氧往往会造成养殖系统内鱼类的大量死亡。斑马鱼具有较快的新陈代谢速率,因而消耗氧气的水平也比较高。建议养殖水体的溶解氧水平基本维持或者不低于6.0mg/L (28.0?C),以维持斑马鱼的健康生长和活动。

然而水体溶氧度也不是越高越好。水体内通空气过度,会造成气体达到和超过饱和浓度,产生大量气泡,对鱼造成致命危害,产生气泡病。

氨氮废物

养殖水体中的氨主要来源于鱼的腮上皮组织释放和粪便排放。含氮废物的主要来源是水体中的有机物(如死鱼,粪便,漂浮食物)的降解。较高的氨氮浓度对鱼类有毒害作用,同时也会造成水体内的电导率升高。水体中的硝化细菌可以将氨氮废物转化为亚硝酸盐,进而转化为硝酸盐,因此对于大型的循环水养殖系统,培养和维持水体内的硝化细菌水平对水体健康非常重要。较低浓度的硝酸盐对鱼类基本无害,但是浓度超过200ppm,就可能对斑马鱼的健康造成影响。因此,监控水体内的氨氮水平,和硝酸盐浓度对维持一个健康的养殖水系是很重要的。

光周期/光照强度

适宜的光周期有利于斑马鱼生长繁殖。斑马鱼在经历暗周期后,光照诱导斑马鱼开始交配产卵,并且交配产卵可以持续一小时左右。24小时连续光照可能导致斑马鱼不产卵。

斑马鱼养殖系统的适宜光周期是14小时的光照周期和10个小时的暗周期。同时,照明系统的渐亮和渐暗可以避免刺激斑马鱼,防止斑马鱼从养殖缸内跳出。

斑马鱼养殖的合适光强范围为水体表面的光强在54-324 lux范围内。光照强度过高会导致水体内的藻类大量滋生,影响斑马鱼的健康。鱼房内灯光太暗,光照不足,会造成斑马鱼的条纹灰暗,活力不足。

 

 

第二节 斑马鱼的规范养殖系统

斑马鱼规范养殖系统由相关设备组成,主要包括:净水供水系统、净水储存及水质控制系统、斑马鱼中央循环养殖系统等(图2.1)。下面依次做出介绍。

1、净水供水系统

净水供水系统主要是通过物理过滤、活性炭过滤和反渗透膜过滤对供水的水质进行有效的净化,去除水中可能含有的泥沙、铁锈、细菌、悬浮物、藻类、大分子有机物等多种有害物质,制造适合于斑马鱼养殖的净水。

经净水供水设备净化后的水质应满足如下要求:

脱盐(Salt rejection) 95 - 98%

有机分子截留(Organic rejection)> 150MW

除菌(Bacteria rejection)99%

除颗粒物(Particle rejection) 99%

电导率(Conductivity) < 30 μS/cm。


2.1 斑马鱼规范养殖系统水体流程图。斑马鱼规范养殖系统的水体流程主要由净水供水系统、水体循环单元(净水储存及水质控制系统和自动化控制及报警单元)、中央循环养殖系统组成。

2、净水储存及水质控制系统

净水供水系统生产的净水在温度、pH和盐度等方面不适宜斑马鱼的生长繁殖。净水储存及水质控制设备能够自动调控净水水质,使水质符合斑马鱼生长繁殖的要求。经调控后的养殖水可以向斑马鱼循环养殖设备补充新鲜的养殖水。该设备主要包括水处理单元和水循环动力单元。

水处理单元具有实时监测和调控净水的温度、pH及盐度等水质参数的功能。经处理后的水质符合斑马鱼养殖水水质的要求。

水循环动力单元驱动净水循环,保证净水的温度及理化性质的均一性。

3、斑马鱼中央循环养殖设备

斑马鱼中央养殖系统能够通过自动化控制为斑马鱼的生长繁殖提供适宜、稳定的和可循环的水环境,支持大规模、多品系的斑马鱼养殖。系统主要包括养殖水处理单元、水循环动力单元、斑马鱼养殖单元和自动化控制及报警单元等。

3.1、养殖水处理单元

食物残渣和鱼类排泄物会导致斑马鱼养殖系统的水质变差,影响斑马鱼的健康。养殖水处理单元具有净化斑马鱼养殖水的功能。该设备主要包括物理过滤单元、生物净化单元、杀菌单元及水质调控单元。

3.1.1 物理过滤单元

物理过滤单元可以有效地去除养殖水体中的悬浮颗粒及其它有害废弃物。该单元由固定过滤筛和活性炭过滤筛组成。在循环水养殖过程中,鱼类的粪便、及其所食饵料的20-60%最终以固体废弃物的形式排入水中,其中,约一半以上是悬浮性固体颗粒物,是养殖水体污染物的主要来源。固定筛过滤筛网能够有效过滤水体中直径≥50μm的固体颗粒。活性炭过滤筛能够有效地将养殖水体中的有机物质杂质吸附到活性炭颗粒内,从而达到去除有机物质的目的。但时间一长,活性炭的吸附能力会不同程度地减弱,吸附效果也随之下降。如果养殖水质混浊,有机物含量高,活性炭很快就会丧失过滤功能。所以,活性炭应定期清洗或更换。活性炭颗粒的大小对吸附能力也有影响。一般来说,活性炭颗粒越小,过滤面积就越大。所以,粉末状的活性炭总面积最大,吸附效果最佳,但粉末状的活性炭很容易随水流入水族箱中,难以控制,很少采用。颗粒状的活性炭因颗粒成形不易流动,水中有机物等杂质在活性炭过滤层中也不易阻塞,其吸附能力强,已经广泛地被使用在斑马鱼循环养殖系统。

3.1.2 生物净化单元

在溶氧充足的水体中,养殖水体中的氨在氨化细菌的作用下,进行有机氮化合物的脱氨基作用,生成氨态氮,即氨化作用;氨氮在亚硝化单胞菌和硝化单胞菌的作用下,使氨氮转化成亚硝酸盐再转化成硝酸盐的过程,即硝化作用。目前,常用的方法是在生物过滤器上附着生物膜进行脱氮。生物膜是一稳定的、多样的微生物生态系统。悬浮于液相中的有机污染物及微生物移动并附着在载体的表面上;然后附着在载体上的微生物对有机物进行降解,并发生代谢、 生长、繁殖。生物膜反应器分为固定床和流化床两类。在固定床中生物膜载体固定不动,在反应器内的相对位置基本不变;在流化床中生物膜载体不固定,在反应器内处于连续流动的状态。生物流化床,生物膜载体在高速水流和气流或机械搅拌作用下不断运动(搅动、流化、循环等)的生物膜反应器。斑马鱼循环养殖系统中最常用的是固定床生物滤器。

3.1.3 杀菌单元

斑马鱼循环养殖系统通常使用紫外灯杀菌。紫外灯发射波长在200-300nm范围的紫外线,都有杀菌能力。其中以265-266nm的杀菌力最强,在波长一定的情况下,紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。可以穿透细菌的细胞膜,被细胞核吸收,对细菌DNA造成损伤,抑制了DNA的复制,破坏了菌体的繁殖能力,从而达到了杀菌的目的。但是紫外线杀菌需要穿透水层才能起作用,因为污水中的悬浮物、浊度等都回干扰紫外光的传播。所以养殖水的水质是保证紫外线消毒的先决条件。

3.1.4 增氧单元

充气式增氧是目前规范化养殖中应用较多的一种方法。用空气压缩机将空气或纯氧通过气石等散气装置,释放为小的气泡,小气泡与水进行传质,将氧慢慢溶于水体中,成为溶解氧。

3.2、水循环动力单元

水循环动力单元能够为斑马鱼养殖水体的循环提供基本的动力。水循环动力单元需具有水流旁路,能够在不关闭主水泵情况下进行系统维护(例如更换UV灯管,清洁pH探头和更换过滤器等);主水泵提供的水循环速率应满足每个养殖缸的水被更换次数不少于5次/小时;系统必须有备用水泵。在主水泵不能工作时,备用水泵能够立刻自动工作;所有主水泵和备用主水泵有减震设计。

3.3 自动化控制及报警单元

3.3.1 水质调控单元

水质调控单元具有实时监测和调控斑马鱼养殖水的理化性质。调控的基本项目有:溶氧度、盐度、温度、pH值。保证这些水质指标都控制在养殖对象的适应范围内。一般要求斑马鱼养殖水体的溶氧不低于在6.0mg/L之间,pH值在7-8之间,电导率在500-800μS/cm。养殖系统对于以上指标应能够实时自动监测,发现某个指标异常,须即时自动调整。

3.3.2 报警单元

具有监控报警功能。当养殖系统中仪器不能正常工作,或者养殖系统水质超出设定范围时,能够自动报警;当养殖系统中仪器不能正常工作时,自动化控制单元能够自动启动备用仪器;自动指令对水体循环净化水仪器补水的功能。

3.4 斑马鱼养殖单元

该单元主要包括斑马鱼养殖架和放置其中的养殖缸。养殖架的制作采用坚固和耐腐蚀的材料。机架可根据斑马鱼房地面坡度进行调节;养殖架整体及各层都能实现水流水量控制。给排水管道(含阀门)易于维修和更换。养殖缸的制作采用优质塑料(例如Polycarbonate, Polysulfone)注塑成型。养殖缸能够防止斑马鱼逃逸(含成年斑马鱼和斑马鱼鱼苗)。

 

 

第三节 正规斑马鱼鱼房的搭建

1、斑马鱼房建设规划

一个正规的斑马鱼鱼房,按功能划分,应该包括以下几个功能区域(图2.2):

斑马鱼主养殖区域。该区域是斑马鱼的中央饲养及繁殖的区域。房间要求温度维持在28?C左右,房间灯控,且具有新风系统。

斑马鱼苗养殖区域。该区域主要用于饲养<3个月的斑马鱼苗。房间要求温度维持在28?C左右,房间灯控,且具有新风系统。

食物准备区域。主要用于准备斑马鱼的食物,例如孵化丰年虫卵。要求温度维持在28?C左右,具有新风系统。

设备间区域。主要用于安装放置净化水设备及水循环动力设备等。房间要求温度维持在28?C左右,具有新风系统。

斑马鱼实验操作区域。主要用于斑马鱼的实验显微操作。房间要求通风干燥。

斑马鱼检疫隔离区域。主要用于外源斑马鱼的隔离养殖,防止外源鱼类传染疾病在斑马鱼房扩散。房间要求温度维持在28?C左右,房间灯控,且具有新风系统。


2.2 斑马鱼鱼房建设规范范例(中国国家斑马鱼资源中心鱼房建设规划图)

2、斑马鱼房基地的选址

斑马鱼房基地的选址应该符合以下要求:

2.1、应避开自然疫源地;

2.2、宜环境安静,远离铁路、码头、飞机场、交通要道等有严重震动或噪声污染的区域;

2.3、 宜环境空气质量较好,远离散发大量粉尘和有害气体的工厂、仓库、堆场;

3.4、 应远离易燃、易爆物品的生产和储存区,并远离高压线路及其设施;

3.5、 宜建设在建筑物的底层。

3、斑马鱼房基础设施的建筑要求

3.1、 货物出入口应设置坡道或卸货平台,坡道坡度不应大于1/10。

3.2、 应充分考虑空调机、通风机等设备的面积需求,并对噪音和震动进行处理。

3.3、 楼层在二层以上的斑马鱼房设施宜设置货梯。

3.4、 楼梯宽度不宜小于1.2m,走廊净宽不宜小于1.5m,门宽度不宜小于1.0m,高度不低于为2.1m。

3.5、 楼层高不宜小于3.5 m。室内净高不宜低于2.4m,并应满足设备对净高的需求。

3.6、 送回风管和其他管线暗敷时,宜设置技术夹层,当采用轻质构造顶棚做技术夹层时,夹层内宜设检修通道。

3.7、 吊顶宜为防潮吊顶,高度统一,高度不低于2.4m。

3.8、 墙面和顶棚的材料应易于清洗消毒、耐腐蚀、不起尘、不开裂、无反光、耐冲击、光滑防水,防霉。

3.9、 地面要求防水处理,且地面整体向地漏处倾斜。

3.10、地面材料应防滑、耐磨、耐腐蚀、无渗漏,踢脚不应突出墙面。潮湿地区的地面垫层应做防潮构造。

3.11、斑马鱼养殖区地面承重荷载不小于1000kg/m2。

3.12、地面设置地漏或排水沟,且应做防水处理。

3.13、房门宜为防潮门,应有良好的密闭性和不透光。

3.14、封闭斑马鱼养殖区域的窗户,保证养殖区统一的光周期。

3.15、应有防止昆虫、鼠等动物进入的措施。

3.16、斑马鱼养殖区安装防潮,耐腐蚀实验台面。

4、斑马鱼房空调系统和新风排风系统

4.1、 空调系统的设计应充分考虑斑马鱼房所在地的自然气候。空调系统应具备维持养殖区域温度在28?C左右。对于冬季气温过低的城市,可考虑安装辅助加热设施,例如燃气取暖等,保证养殖区域温度维持在28?C左右。

4.2、 空调系统的安装便于日常的维修工作。

4.3、 空调系统宜自动控制功能和节能运行。

4.4、 空调系统宜具有抽湿功能。

4.5、 新风排风系统具除尘净化,除湿(湿度不大于60%)功能。

4.6、 新风排风系统宜具有自动控制功能和节能运行。

4.7、 新风排风系统新风量宜≥5倍养殖区域体积/小时。

4.8、 新风排风系统加全热式换热器,节能环保。

4.9、 新风排风系统所铺设的管道应防潮和耐腐蚀。

4.10、 斑马鱼检疫隔离区域应具有独立的空调系统及新风排风系统。

5、给水排水系统

5.1 给水

5.1.1 供水应符合国家标准GB 5749《生活饮用水卫生标准》的要求。

5.1.2 给水管道,应选用不生锈、耐腐蚀和连接方便可靠的管材。

5.1.3 管道外表面可能结露时,应采取有效的防结露措施。

5.1.4 管径DN25,供水量宜大于4m3/h,水温15-25?C,供水压力大于0.1Mpa, 小于0.4Mpa;接口设置阀门。

5.1.5 斑马鱼检疫隔离区域应独立给水。

5.2 排水

5.2.1 净水供水单元设备排水地漏DN80,最大排水量大于4m3/h。

5.2.2 循环单元排水地漏DN50,最大排水量大于2m3/h。

5.2.3 养殖单元排水排水地漏DN50,最大排水量大于2m3/h。

5.2.4 给水管道,应选用不生锈、耐腐蚀和连接方便可靠的管材。

5.2.5 斑马鱼检疫隔离区域排水宜与建筑生活排水分开设置。

5.2.6 排水管道应采用不易生锈、耐腐蚀的管材。

6 电气

6.1 配电

6.1.1 斑马鱼鱼房养殖区域用电负荷不宜低于2 级,宜设置备用电源。

6.1.2 总供电要求:配电时应考虑用电平衡,空调供电、水体循环单元设备供电、插座供电每一路供电安装独立的断路器。

6.1.3 斑马鱼养殖区所使用的开关、插座、空开和配电箱等设备的安全等级不低于IP65。

6.1.4 设置专用配电柜,配电柜宜设置在通风干燥的房间。

6.1.5 如供电电压/电流不稳定,宜加装稳压设备。

6.1.6 斑马鱼养殖区域设施的电气管线应暗敷,设施内电气管线的管口,应采取可靠的密封措施。

6.1.7 配电管线宜采用金属管,穿过墙和楼板的电线管应加套管,套管内应采用不收缩、不燃烧的材料密封。

6.1.8 水体循环单元设备供电设380V(±5%),50Hz。三相五线制电源,线径不小于10mm2; 安装四极漏电保护断路器,零线排、地线排。

6.1.9 净水供水单元设备供电设380V(±5%),50Hz。三相五线制电源,线径不小于10mm2; 安装四极漏电保护断路器、地线排、零线排。

6.1.10 独立养殖单元供电220V(±5%),50Hz,10A插座。

6.1.11 食物培养器供电220V(±5%),50Hz,10A插座。

6.2 照明

6.2.1 照明灯具应采用密闭洁净灯,安全等级不低于IP65。

6.2.2 斑马鱼养殖区照明系统可自动化控制,可定时开关独立控制。

6.2.3 安装应急照明系统。

6.3 消防

6.3.1 新建斑马鱼房建筑的周边宜设置环行消防车道,或必须沿建筑的两个长边设置消防车道。

6.3.2 基础设施的耐火等级不应低于二级,或设置在不低于二级耐火等级的建筑中。

6.3.3 斑马鱼房吊顶空间较大的区域,其顶棚装修材料应为不燃材料且吊顶的耐火极限不应低于0.5h。

6.3.4 吊顶内可不设消防设施。

6.3.5 应设置火灾事故照明。疏散走道和疏散门均应设置灯光疏散指示标志。火灾事故照明和疏散指示标志可采用蓄电池作备用电源,但连续供电时间不应少于20分钟。

6.3.6 宜设火灾自动报警装置。

6.3.7 不应设置自动喷水灭火系统。

6.3.8 斑马鱼养殖区宜配置对斑马鱼无毒和对养殖设备无损害的灭火设备。

6.3.9 应设置消火栓系统且应保证两个水枪的充实水柱同时到达任何部位。

 

 

第四节 斑马鱼鱼房的管理

1、人员管理

斑马鱼养殖人员及实验操作人员岗前接受培训。培训内容包括:斑马鱼房设施的特点、斑马鱼房管理方法及操作规程等。

2、合理安排各项消毒的事项

斑马鱼房常用器具需定期消毒灭菌。捕捞斑马鱼的渔具和收集受精卵的滤网需浸泡在消毒液中,使用前后用清水充分冲洗。使用完毕后放回消毒液中浸泡。消毒液需每周更换。玻璃器皿需定期高压灭菌。其它不适于高压灭菌的器皿,应使用消毒液消毒灭菌。斑马鱼房墙面和地面需每周使用消毒液清洗消毒。

斑马鱼房隔离养殖区的任何器具在未经消毒处理前不得带离该区域。在隔离养殖区收集的受精卵需经过消毒后方可转移至斑马鱼房内部养殖区养殖。

3、斑马鱼养殖系统的维护及保养

斑马鱼养殖系统是一种较为复杂、价格昂贵的大型贵重仪器,而且需要连续运转,因此对设备的维护保养至关重要。为了保证斑马鱼养殖系统的正常运行,斑马鱼房管理人员需坚持如下的检查项目:

3.1、 每天检查系统运行电压等参数是否符合系统运行的要求。

3.2、 检查紫外灯是否正常工作。

3.3、 检查系统pH、温度、电导率及溶氧度是否在规定范围内。

3.4、 定期清洗各种检测探头。

3.5、 每周检测养殖水中的氨氮含量。

3.6、 每2-4周更换过滤棉袋及活性炭

3.7、 每月检查斑马鱼养殖系统的控制系统及报警系统的各种开关、换能器、电池、表头和保险丝的接触情况和运行情况,确保机组正常运行。

3.8、 空调机、排风机要经常保养。

3.9、 与斑马鱼养殖系统制造商建立系统年检制度,每年由制造商对系统做系统全面的维护。

4、斑马鱼房巡视制度

每天早晚两次由专人检查斑马鱼养殖区养殖缸及斑马鱼状态。如发现病死鱼需及时处理,并做记录。

5、物品及养殖耗材的管理

斑马鱼鱼房的养殖耗材需统一存放,并建立领用登记制度。同时,为了保证环境的清洁度,应尽量减少人员进出的次数及保证物品的消毒、灭菌。物品进入斑马鱼房之前,必需经消毒灭菌处理。

 

第五节 斑马鱼的饲养和传代

1、斑马鱼的饲养

斑马鱼的最适生长温度为28.5?C。受精卵被收集之后,5天之内的胚胎可在培养皿内静水培养。可以使用普通养鱼水或者胚胎培养基,置于28.5?C恒温温箱内,每天换水,培养密度不宜超过每个培养皿(90mm)50个胚胎。斑马鱼胚胎在5天之内不需喂食。

5到15天的幼苗,可以转移到大的培养器皿中继续静水培养。1L体积内不宜放置超过100尾幼苗。每天需要更换至少50%体积的水。可在培养用水或溶液中加入1/10000体积的亚甲基蓝,抑制霉菌生长。斑马鱼的幼苗在出生后第5天开口进食,在此阶段及时提供食物可以促进斑马鱼幼苗的成活率。斑马鱼幼苗常见的食物是新鲜孵化的草履虫(paramecia)或者轮虫(rotifer)。每天喂食2-3次。

15天以上的幼苗,可以开始使用滴水法的近似静水培养,不需继续换水。如果条件不具备,需要继续静水喂养,则需要使用更大体积的养殖水,1L体积内不宜放置超过30尾幼苗。15天以上的斑马鱼可以开始喂食丰年虾(artemia,又称丰年虫,卤虫)的幼虫,一天喂食2-3次。其中12天至15天的幼苗,可以采用草履虫和丰年虾混合喂养的方式,让幼苗适应新食物。

30天以上的幼鱼,可以开始正常上架,进入水循环系统。养殖密度以5尾/L为佳。一天应喂食2-3次丰年虾的幼虫,也可搭配喂食固体颗粒饲料。正常喂养的情况下,3个月大的斑马鱼即可性成熟,交配产生下一代。

2、斑马鱼的配鱼和鱼卵收集

斑马鱼的交配行为需要光周期的生物钟控制,在每次光周期开始时应激进入交配产卵的状态。这时候雌雄鱼相遇则有可能交配产卵。健康的斑马鱼性成熟后即可开始交配产卵,6个月到18个月大的斑马鱼是生产的高峰期,一对健康的斑马鱼一次交配可产受精卵200枚以上。

配鱼时间应在需要收集鱼卵的前一天傍晚。使用配鱼专用缸,把内缸(底部有漏网)套入外缸之内,加入约2/3缸水,用隔板把雌雄鱼分开(图2.3)。每缸按照雌雄鱼1:1或者2:1的比例放置鱼。密度不宜过高。

 

2.3 建立自然交配和鱼卵收集。左侧,配鱼样式,在外缸内放置内缸,一雌一雄以隔板分开。缸内加水2/33/4,盖上缸盖。右侧,以培养皿收集到的斑马鱼鱼卵。

第二天早晨,光周期开始后,可按需要的时间把隔板抽开,让雌雄鱼交配产卵。一般相互接触后雄鱼会追逐雌鱼,15分钟之后雌雄鱼开始交配产卵。所产受精卵会从内缸底部漏下,进入外缸,避免成鱼接触和吃掉受精卵。每次收集受精卵都可直接将内缸拿出,换入另外一个外缸,把原缸内的受精卵随手倒入收集网内,用水冲洗到培养皿内(图2.3)。

如果收集受精卵是为进行显微注射实验,则可通过设定抽开隔板时间,控制雌雄鱼接触的方法控制受精卵的年龄,保证收集到同一时期的受精卵。但是光周期开始2小时后,雌鱼如果未能接触到雄鱼,则开始消化体内未排出的卵,鱼卵质量开始下降。所以受精卵收集工作应尽量在光周期开始后2小时内进行。

本节附录:

养鱼水:以约0.06g海盐加入1L的蒸馏水中(终浓度约60μg/ml),充分溶解即可。

草履虫培养:将小麦粒干热灭菌后,加水煮15分钟,分装在无菌容器内,4?C保存备用。在每1L净水中加入1g酵母粉,1ml全脂牛奶,1gNaCl,混入约15粒煮熟的麦粒,接入2ml草履虫种源,静置培养5-7天左右可用。

丰年虫培养:在12L水中,加入约300g海盐,1勺NaHCO3(6-10g),50g丰年虫卵,通气培养24小时可用。

 

 

第六节 斑马鱼的体外受精技术

斑马鱼作为实验工具的一大优势是体外受精,精子可冻存,保持较长时间的活力。在常规的实验操作中,体外受精也提供自然交配产卵无法完成的帮助。例如在实验中一次性需要大量的同基因型胚胎,或需要严格同一时间受精的同龄鱼卵,或鱼本身有缺陷无法完成自然交配的过程的情况下,体外受精都可满足实验所需胚胎收集要求。

做体外受精之前一天,应和自然配鱼一样,把雌雄鱼在同一缸内分隔放置。做体外受精的当天早晨,需配制新鲜的Hank’s buffer。

做体外受精,首先收获精子样品。以浓度为0.016% 的tricaine麻醉雄鱼,用柔软吸水的纸吸净鱼身上的水分。吸干水分对于取得可长时间保存的精子样品非常重要,精子遇水则被激活,如不能与卵接触则很快失去活性,所以要尽量吸干鱼身上的水分,尤其是泄殖孔(cloaca)周围的水分,避免水分混入精子样品。将麻醉好的雄鱼固定在海绵垫上,以圆头或扁头,表面和边缘都很光滑的镊子,轻轻挤压雄鱼的腹部,同时用毛细针吸入乳白色的精子样品(图2.4)。将收获的精子样品(1-2μl)溶于50μl Hank’s buffer,置于冰上保存。质量好的精子样品在4?C保存的条件下,可保持活性2-3天。

精子样品准备好后,可以开始收获未受精鱼卵。同样将雌鱼麻醉,并吸干鱼身上的水分,置于小号培养皿内,用润湿的手指轻轻按压雌鱼的腹部,得到未受精的鱼卵。质量好的鱼卵为粘稠状、淡金黄色。收获的鱼卵如果颜色苍白、或水状、或内部含有絮状物,则为质量差的鱼卵或者死卵,无法被正常受精,应该弃之不用。收获到质量好的鱼卵之后,迅速将混有精子样品的50μl Hank’s buffer与之混合,然后加入750μl养鱼水激活精子。室温放置3-5分钟后,可加入养鱼水至培养皿的2/3体积,将培养皿放入28?C培养箱。体外受精完成。

 

2.4 体外受精实验,分别收获精子和卵子。左图为以毛细针收获精子的操作,高质量的精子样品为乳白色。右图为高质量的未受精鱼卵,为粘稠状、淡金黄色。(引自:J vis 2009, PMID:19581874)

受精完成后3-5小时,应把受精卵与未能受精的卵和死卵分开,单独放入90mm培养皿进行培养。如果体外受精的胚胎用于显微注射,则在卵子和精子混合10分钟后可开始进行显微注射实验。

本节附录:

Hank’s buffer制备:

Hank’s stock #1: 8g NaCl, 0.4g KCl, 溶于100ml水中,过滤除菌,4?C可保存半年。

Hank’s stock #2: 0.358g Na2HPO4, 0.6g KH2PO4, 溶于100ml水中,过滤除菌,4?C可保存半年。

Hank’s stock #4: 0.72g CaCl2, 溶于50ml水中,过滤除菌,4?C可保存半年。

Hank’s stock #5: 1.23g MgSO4·7H2O, 溶于50ml水中,过滤除菌,4?C可保存半年。

Hank’s premix: 10ml stock #1, 1ml stock #2, 1ml stock #4, 1ml stock #5, 86ml无菌水,4?C可保存半年。

使用Hank’s buffer的早晨,新鲜配置3.5% NaHCO3 (0.35g NaHCO3溶于10ml水中)。

混合9.9ml Hank’s premix, 0.1ml 3.5% NaHCO3溶液,即为使用的Hank’s buffer。

 

 

第七节 斑马鱼的安乐死

使用后妥善处理实验动物,是实验动物伦理学的要求。在处理实验动物的过程中,应该秉着尽量温和,减少动物痛苦的方法。

斑马鱼的自然寿命是2-5年,在实验室中,由于18个月以上的斑马鱼开始老化,产卵减少,免疫力降低,容易感染细菌,或生长肿瘤,可及时的施以安乐死处理。常用的斑马鱼安乐死方法有2钟:高剂量麻醉法和冰浴法。

成年斑马鱼可以使用高剂量麻醉法。将成鱼浸入5X 高浓度的tricaine溶液(第一章第六节附录)中,观察鱼鳃的活动。鱼在麻醉剂中会缓慢停止呼吸。鳃动停止后继续浸泡10-15分钟,以保证鱼已死亡。之后可按照生物医学实验垃圾处理。

冰浴法可用于成年斑马鱼或2天以上的幼鱼。用于幼鱼时,将养殖有幼鱼的水和大量的冰充分混合30分钟后,可视为幼鱼已死亡。成年鱼可直接将鱼捞出,浸入冰水混合液中(保证有足够体积的冰)。鱼在冰水中心跳会逐渐放缓到彻底停止。冰浴浸泡20分钟以上,可视为鱼已死亡。之后可按照生物医学实验垃圾处理。

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