全胚原位杂交技术

第五章 斑马鱼全胚胎原位杂交技术

 

第一节   原位杂交技术的历史

Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。

Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本 （Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 – 69）。

 

 

第二节 原位杂交技术的原理

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

整胚原位杂交（whole-mount in situ hybridization）不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位。整胚原位杂交指在胚胎组织或细胞结构保持不变的条件下，用标记的已知的RNA核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体 (Hybrids）经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的mRNA、rRNA和tRNA分子。该技术不仅可以用于检测基因的时空表达, 为研究该基因功能以及基因分类提供线索，还可以应用于高通量药物筛选或突变体筛选中, 以特异表达的基因标记作为筛选的重要依据。（图5.1）

图5.1 斑马鱼整胚原位杂交技术原理。地高辛标记的反义RNA 探针与细胞内的mRNA 特异性结合, 利用免疫组织化学的方法, 碱性磷酸酶结合的抗地高辛抗体与杂交的核酸探针特异性结合, 然后用碱性磷酸酶的发光底物进行显色。图中原位杂交结果为24 hpf myl7和tpma基因的表达情况。

 

 

第三节 原位杂交技术的要点

由于核酸探针的种类和标记物的不同，在具体应用的技术方法上也各有差异，但基本方法和应用原则大致相同。主要包括以下几步：

杂交前准备（取材和固定）

组织的处理（增强核酸探针的穿透性/减低背景染色）

杂交反应

杂交后处理

显示（放射性自显影或非放射性标记的显色）

1、固定

原位杂交技术(In Situ Hybridization, ISH)在固定剂的应用和选择上应兼顾到三个方面：保持细胞结构，最大限度地保持细胞内DNA或RNA的水平，使探针易于进入细胞或组织。

DNA是比较稳定的，mRNA是相对稳定的但易为酶合成和降解。故对于DNA的定位来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。而在RNA的定位上，要使RNA的降解减少到最低限度，不仅固定剂的种类浓度和固定的时间十分重要，而且取材后应尽快予以冷冻或固定。最常用的固定剂是多聚甲醛，多聚甲醛不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，因而不会影响探针穿透入细胞或组织。我们常采用的方法是将组织固定于4%多聚甲醛磷酸缓冲液中置4?C冰箱过夜。

各种固定剂均有各自优缺点，如沉淀性(Precipitating)固定剂：酒精/醋酸混合液、Bouin’s液、 Carnoy’s液等能为增加核酸探针的穿透性提供最佳条件，但它们不能最大限度地保存RNA，而且对组织结构有损伤。戊二醛能较好地保存RNA和组织形态结构，但由于和蛋白质产生广泛的交叉连接，从而大大地影响了核酸探针的穿透性。至今，多聚甲醛仍被公认为ISH较为理想的固定剂。

2、组织的处理

2.1、增强组织的通透性和核酸探针的穿透性

此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类和核酸探针的长度而定。比如用戊二醛固定的组织由于其与蛋白质产生广泛的交叉连接就需要应用较强的增强组织通透性的试剂。增强组织通透性常用的方法如应用稀释的酸洗涤、去垢剂(detergent)或称清洗剂Triton X-100、酒精或某些消化酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶、胶原蛋白酶和淀粉酶(diastase)等。这种广泛的去蛋白作用可以增强组织的通透性和核酸探针的穿透性，提高杂交信号，但也会影响组织结构的形态，因此应掌握好用量和孵育时间。

使用较为广泛的是蛋白酶K(Proteinase K)，一般工作浓度为1μg/ml，孵育时间视胚胎组织发育阶段而定，跨度从1到30min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为准。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。在蛋白酶K消化后，应用0.1mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用，甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。

2.2、减低背景染色

ISH中背景染色的形成是诸多因素构成的。预杂交和杂交后的洗涤均有助于减低背景染色。将固定的组织浸入预杂交液中可达到封闭非特异性杂交点的目的，从而减低背景染色。有的实验室在杂交后洗涤中采用低浓度的RNA酶溶液(20 μg/ml)洗涤一次，以减低残留的和内源性RNA，减低背景染色。

2.3、防止RNA酶的污染

由于在手指皮肤及实验用玻璃器皿上均可能含有RNA酶，为防止其污染影响实验结果，在整个杂交前处理过程都需戴消毒手套。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温烘烤或使用DEPC过夜处理以达到消除RNA酶的目的。要破坏RNA酶，其最低温度必须在150?C左右。可以在消毒的玻璃器皿外包以锡箔纸以利于标记和防止取出时空气污染。杂交前及杂交时所应用的溶液均需经高压消毒处理。

3、杂交反应

杂交前的一切准备工作如增加组织通透性都是为了在杂交这一步骤中核酸探针能进入细胞或组织与其内的靶核苷酸相结合，杂交是ISH中关键且最重要的一个环节。要获得满意的实验结果，在杂交这一实验过程中还须注意以下的环节。

3.1、探针的浓度

很难事先确定每一种实验探针的浓度，但要掌握一个原则，即探针浓度必须给予该实验最大的信/噪比值。背景染色的高低也与探针浓度有关。

原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或化学显色法予以检测。探针浓度依其种类和实验需要略有不同，放射性标记的dsDNA或cRNA探针浓度在1～5 ng/μl，而非放射性标记（生物素或地高辛）cRNA探针，其最佳浓度在0.5～5 ng/μl。同时杂交液的量要适当，过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反易导致高背景染色等不良后果。

我们实验中使用的是以地高辛(DIG)标记的反义RNA探针，通过DNA 转录而来的。常采用的方法是以总RNA 反转录产物为模板, 克隆得到相应的DNA 片段, 并将该片段连接到pGEM-T 或pGEM-T easy 载体中, 通过转化获得反向重组质粒。并以此为模板, 在体外用相应的T7 或T3 RNA 聚合酶进行转录（应避免使用SP6 RNA 聚合酶，整合DIG标记的UTP效率较低）。相对于直接用PCR产物为模板转录得到反义RNA 探针的方法, 该方法所需时间比较长, 但探针获得量较大, 而且各阶段所得的产物相对比较稳定, 可长时间储存。

3.2、探针的长度

用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA，也可以是RNA探针。对于反义RNA 探针，要想获得较理想的标记效果，长度最好大于1 Kb。有时候短探针也可以获得较好的效果，但最短也不宜小于200 bp。当两个基因的序列相似度较高，设计特异性的探针相当有挑战性。一般而言探针长度为200~1200 bp，过长则杂交效率减低。为减少非特异性结合，在设计探针时常常选择覆盖部分3’非翻译区（3' untranslated region, UTR）。

3.3、杂交的温度和时间

杂交的温度也是杂交成功与否的一个重要环节，DNA或RNA需加热或变性、解链后才能进行杂交。能使50%的核苷酸变性解链所需的温度，叫解链温度或融解温度(melting temperature, 简称Tm)。原位杂交中，多数DNA探针需要的Tm是90?C，而RNA则需要95?C。这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。Tm值与盐的浓度、探针的长度、甲酰胺的百分比等诸多因素有关。因此，在杂交的程序中常规的加入30%～50%甲酰胺(formamide)于杂交液中。McConaughy发现，反应液中每增加1%的甲酰胺浓度，Tm值可降低0.72?C。此外还可以通过调节盐浓度的办法来调节Tm。在实际操作中，采用的杂交温度在（Tm-25?C）左右，即比Tm减低25?C，大约在50～70?C之间，根据探针的种类不同，温度略有差异。

杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性染色。理论上核苷酸杂交的有效反应时间在3h左右，为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h（杂交孵育过夜）。杂交反应的时间与核酸探针长度与组织通透性有关，在确定杂交反应时间应予以考虑，并经反复实验确定。

此外，甲酰胺还可防止在低温时非同源性片段的结合，但甲酰胺具有破坏氢键的作用从而具有一种不稳定的作用。故有研究者主张杂交反应的孵育应在黑暗环境中进行，因为光线会促进甲酰胺的电离作用。

3.4、杂交严格度

杂交严格度(Hybridization stringency)表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。不完全配对杂交体的稳定性较完全配对杂交体差，通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低，反应亦然。一般来说，低严格度杂交及冲洗条件在（Tm-35?C）至（Tm-40?C）之间，高盐或低甲酰胺浓度下，大约有70%～90%的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。中严格度，（Tm-20?C）至（Tm-30?C）的范围。高严格度为（Tm-10?C）至（Tm-15?C），低盐和高甲酰胺浓度下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。

原位杂交技术多数是在Tm-25?C进行的，不属于高严格度范围，会产生非特异性结合导致信/噪比减低。在这种情况下，可用加强杂交后冲洗的严格度使非特异性的杂交体减少。由于RNA杂交的稳定性，应用cRNA探针进行细胞或组织的原位杂交时的杂交温度比其它核酸探针要高10～15?C。实验证明，cRNA产生的信号比双链cDNA要强。单链的RNA探针其杂交信号大于双链的cDNA的约8倍。

 

4、杂交后处理

杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。因为大多数的原位杂交实验是在严格度不高的条件下进行的，非特异性的结合会增强背景染色。RNA探针杂交时产生的背景染色特别高，但能通过杂交后的洗涤有效地减低背景染色，获得较好的反差效果。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，一般遵循的共同原则是盐溶液浓度由高到低。在漂洗液中常加入Tween-20，有复性抗原的作用，可提高特异性的识别能力。Tween-20为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物，是一种非离子型去污剂。如何控制漂洗的严格度从而达到理想的信/噪比无既定方案可循，必须从反复的实践中取得经验。

在做抗体反应前，需要先用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭组织上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换靶标，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20（0.05 - 0.1%）稀溶液。

 

5、显示

根据核酸探针标记物的种类分别进行放射自显影或利用酶检测系统进行不同显色处理。放射自显影可利用人工或计算机辅助的图象分析检测仪(computer-assisted image analysis)检测银粒的数量和分布的差异。非放射性核酸探针杂交的细胞或组织可利用酶检测系统显色。

5.1、几种常见探针及其特点

探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子。根据在杂交中所使用的探针依其来源可分为三种：即特异性cRNA、cDNA探针和人工合成寡核苷酸探针。

cRNA探针

cRNA探针是以cDNA为模板，通过体外转录而获得的单链探针。cRNA与RNA之间形成的杂交体要比cDNA-RNA杂交体稳定。cRNA-RNA杂交体不受RNA酶的影响，杂交反应后可用RNA酶处理，以除去未结合的探针。cRNA探针的杂交饱和水平又比双链DNA探针高出8倍，在原位杂交中应用广泛。但cRNA探针的制备过程比较复杂，需要较好的分子生物学实验设备，它对RNA酶敏感，易降解，操作中要谨防RNA酶污染。

单链cDNA探针

由于cDNA中不存在内含子及其它高度重复序列，又克服了双链cDNA探针在杂交反应中两条链之间复性的缺点，从而提高了杂交反应的敏感性。但由于单链cDNA探针的制备比较困难，在RNA原位杂交中已很少见有应用。

寡核苷酸探针

人工合成的寡核苷探针是以核苷酸为原料，通过DNA合成仪合成，避免了真核细胞中存在的高度重复序列带来的不利影响。由于大多数寡核苷酸序列较短，不需要纯化，组织穿透性极好。根椐目的基因的特异性序列设计的探针，特异性较强。合成的寡核苷酸探针的缺点是：探针长度必须适宜，探针太长可造成内部错误配对杂交，探针太短可形成非特异性结合。它与mRNA形成的杂交体不如cRNA-RNA杂交体稳定，再则探针较短，所携带的标记物少，敏感性较低。

探针设计的位置很重要,为了避免检测mRNA时基因组序列的干扰，设计探针时尽量选择在跨内含子的部位，就是能检测到mRNA，但检测不到基因组序列。

依标记物不同，探针又可分为同位素标记探针和非同位素标记探针两大类。前者主要包括³H 、³⁵C、³²P和¹²⁵I等，不同的同位素探针其穿透力，定位和半衰期各不相同，无一种同位素探针具有穿透力强、定位好和半衰期长所有优点。由于半衰斯短，性能不稳定，污染环境和危害健康等原因，在RNA原位杂交中应用同位素标记探针已日趋减少，而非同位素标记探针在近年来得到迅速发展，其标记物主要有生物素、地高辛、酶和荧光标记等。其中地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干扰等缺点，其应用越来越广泛。

 

 

第四节 斑马鱼整胚原位杂交实验流程

斑马鱼整胚原位杂交（whole-mount in situ hybridization, WISH）技术流程如图5.2所示，蓝色框部分表示探针合成，深绿色部分表示材料准备，浅绿色部分表示WISH第1天实验内容，黄色部分代表WISH第2天实验内容，橙黄色部分表示WISH第3天实验内容，粉色部分表示WISH最后一步。每一步实验需要的时间在框旁注明（O/N：过夜处理）。箭头上并行的两条红线表示WISH可在上一步结束后依据相应条件有较长时间中断而不影响实验结果。（图5.2）

1、探针制备

探针制备体系如下表所示

Component	Amount per reaction	Final
Linear Template DNA	6.0 μl	100-200 ng
5x Transcription buffer	2.0 μl	1X
DTT 0.1M	——	10 mM
DIG-RNA labeling mix (UTP)	1.0 μl
RNAsein (40U/μl)	0.5 μl	10 U
T3 or T7 RNA polymerase (20U/μl)	0.5 μl	5U
Total	10 ul

 

图5.2 整胚原位杂交技术流程图 （引自：Thisse, C. and Thisse, B., 2008）

 

1)      混匀后在37°C 反应2小时。

2)      10 μl的反应体系中加入2 μl RNAse-free DNAse I和18 μl RNAse-free水。混匀后在37°C 反应30 min。

3)      加入1 μl RNAse-free的 0.5 M EDTA 和 9 μl RNAse-free水终止反应。

4)      将Sigma spin Post Reaction 纯化柱放入一个收集管中，750 g (=2800 rpm)离心15 s。

5)      将纯化柱去尾去盖，750 g离心2 mins。

6)      将纯化柱放入一个新的RNAse-free的EP管中，将RNA反应液慢慢加入到纯化柱的凝胶柱上，750 g离心4 mins。

7)      加入1 μl RNAse-free的EDTA 0.5M 和 9 μl of RNAlater （RNAlater 有防止RNA降解的作用，毒性较大，小心操作)，取1-2 ul合成液电泳检测。

 

2、材料准备

1)      收集斑马鱼受精卵，放于35mm平皿中，加入少量的egg water覆盖胚胎即可。

2)      待胚膜略微膨起，加入100-200 ul Pronase (1/100比例加入，储液为20 mg/ml)，混匀，定时查看，一般消化1min左右。

3)      当观察到有个别胚胎出膜，立即将整皿胚胎转入装满养殖水的250 ml烧杯中，轻轻洗3次，即可将大部分的胚膜脱除。

4)      使用玻璃吸管将胚胎转入盛满0.3 x Danieau medium 的2%琼脂平皿中，注意此时的胚胎十分脆弱，应小心操作，保持处于液面下，避免接触空气。重复操作一次后即可转入干净的琼脂平皿中饲养。

5)      养殖密度大约是100枚胚胎/100 mm平皿，胚胎尽量分散培养，以保证充足的生存空间。

6)      28.5度生化培养箱中培养，前2天每半天换一次新鲜的0.3 x Danieau medium。

7)      当胚胎发育到目标时期，使用4% (wt/vol) 多聚甲醛（PFA, paraformaldehyde）PBS缓冲液4?C固定过夜。

8)      胚胎于24 hpf开始出现少量的黑色素，后期日渐增多，色素会影响观察。一般采取在体节期或20 hpf时加入1-Phenyl-2-Thiourea (PTU，使用浓度为0.0045%)，以阻断色素形成，一天换一次液。或者使用双氧水处理，以去除色素。

9)      第二天进行梯度脱水：将固定的胚胎从4%多聚甲醛中逐步替换成100%甲醇(三次每次15min)。

10)   更换新鲜的100%甲醇，在-20?C 保存，可达数月之久。待用胚胎最好在甲醇中过夜或至少2个小时，可以使组织间的空隙更大，利于探针的结合。

 

3、原位杂交

原位杂交第一天

梯度复水（室温下）

1)      1次x 5 min                                          100% Methanol

2)      1次x 5 min                                           75% Methanol -25% PBS

3)      1次x 5 min                                           50% Methanol -50% PBS

4)      1次x 5 min                                           25% Methanol -75% PBS

5)      4次x 5 min                                           PBT (PBS 1 x / tween20 0.1%)

蛋白酶处理与固定（室温下）

6)      胚胎杂交前应先使用蛋白酶K（储液为10 mg/ml，以1/1000比例加入PBT稀释）处理，以疏松组织，便于杂交。发育时期不同的胚胎采用不同消化的时间（下列时间以供参考）。

              For embryos at 75 % epiboly (Gastrula)                             0 min

              For embryos from 5-6 somites (ES)                                  1 min

              For embryos from 18-20 somites (MS)                             3 min

              For embryos of 24 h                                                          10 min

              For embryos of 36 h                                                          20 min

              For embryos of 48 h and later                                            30 min

7)      终止酶消化与固定： 1次x 20 min  4% PFA-PBS

8)      洗脱：5次 x 5 min  PBT

9)      将胚胎转入1.5 ml RNAse-free 的EP管中。

 

图5.3 原位杂交第一天，在24孔板中胚胎梯度复水与蛋白酶K处理过程图示。

预杂交反应

10)   每管胚胎中置换成大约0.6 到 1 ml 杂交液，70?C水浴，预杂交2-5小时（3-4小时为宜）。

杂交液（HM）配方：

	volume	final
Formamide	25,0 ml	50% formamide
20 x SSC	12,5 ml	5 x SSC
Heparin 5 mg/ml	0,5 ml	50 μg/ml
tRNA 50 mg/ml	0,5 ml	500 μg/ml
Tween 20 20%	0,25 ml	0,1%
Acide citrique 1M	0,46 ml	-> pH 6
H2O	to 50 ml

ü  对于信号较强，不需要过长孵育时间的探针，无需在杂交液中加入heparin 和 tRNA。

ü  胚胎在杂交液中的保存时间：4度可以存放一天，-20度可以存放数个星期。

杂交

11)   吸去预杂交液，加上200 ul已加入探针的杂交液（包含30-100 ng探针）

12)   70?C 水浴过夜

 

原位杂交第二天

漂洗

回收探针，放于－20?C保存（通常探针可重复使用3次左右）

使用HM/SSC混合液，2xSSC和0.2xSSC进行梯度漂洗

1)      1次x 10 min   75% HM / 25% 2 x SSC     at 70°C

2)      1次x 10 min   50% HM / 50% 2 x SSC     at 70°C

3)      1次x 10 min   25% HM / 75% 2 x SSC     at 70°C

4)      1次x 10 min   2x SSC                at 70°C

5)      2次x 30 min   0.2 x SSC                  at 70°C

6)      1次x 10 min   75% 0.2 x SSC / 25% PBT        at RT

7)      1次x 10 min   50% 0.2 x SSC / 50% PBT        at RT

8)      1次x 10 min   25% 0.2 x SSC / 75% PBT        at RT

9)      1次x 10 min   PBT                        at RT

封闭反应

10)   在胚胎中加入1 ml blocking buffer，室温下在摇床上低速反应3-4小时。

blocking buffer：在PBT中加入2%羊血清和2 mg/ml BSA

抗体反应

11)   按1：5000的比例在blocking buffer中加入Anti-Dig-AP（酶连地高辛抗体），稀释好后加入胚胎中（500-1000 ul），4度下摇床上低速反应过夜。

原位杂交第三天

漂洗

1)      弃抗体反应液，PBT快速漂洗一次

6次x1 5min    PBT    at RT

摇床上低速漂洗

最后一次漂洗后在转移至下一个溶液前，应尽可能移去前PBT溶液，以防在胚胎上形成磷酸盐沉淀。

2)      碱性tris缓冲液（alkaline tris buffer）快速漂洗一次

3次x 5 min     alkaline tris buffer     at RT

摇床上低速漂洗

碱性tris缓冲液（alkaline tris buffer）配方：

	volume	final
Tris HCl pH 9,5 1M	10 ml	100 mM
MgCl2 1	5 ml	50 mM
NaCl 5M	2 ml	100 mM
Tween 20 20%	0,5 ml	0,1%l
H2O	to 100 ml

 

显色反应

3)      小心吸去多余的alkaline tris buffer，加入700 ul 新鲜配制的显色液

显色液：20 ul NBT-BCIP/ 1 ml alkaline tris buffer

4)      将胚胎转移到12孔白瓷盘，室温下避光显色

半小时以内，每5 min查看一下胚胎显色情况

1小时以后，每30min或1hr查看一下胚胎显色情况

5)      显色成功后，及时吸去多余的显色液，加入1 ml stop solution（PBS pH 5,5 EDTA 1 mM）终止反应

1次x 10 min     stop solution     at RT

1次x 30 min     stop solution     at RT

1次x 1 hr           stop solution     at RT

摇床上低速漂洗。胚胎可以在stop solution中避光保存数月至数年

6)      将胚胎转入6孔板盛放的100%甘油中，注意尽量少带入stop solution，室温下摇床上低速避光平衡过夜，以保证胚胎中的水和甘油的充分交换，增加胚胎的光透性。

7)      第二天使用Olympus显微镜，使用顶光源进行拍照，保存照片。将胚胎转入6孔板盛放的100%甘油中，注意尽量少带入stop solution，室温下摇床上低速避光平衡过夜，以保证胚胎中的水和甘油的充分交换，增加胚胎的光透性。

图5.4 原位杂交第三天，胚胎显色反应观察图示

图5.5 拍照用载玻片图示

 图示中的载玻片分别在两侧用胶水粘附有3-4层盖玻片，具体使用几层视胚胎厚度而定，大于24 hpf的胚胎，建议使用3层盖玻片，小于24 hpf的胚胎，建议使用4层。胚胎在100%甘油中平衡过夜后，可以进行拍照，先在载玻片中间滴一小滴甘油（不能太多，勿将两端盖玻片桥连起），将一个胚胎转入油滴中，盖上长盖玻片，通过轻轻移动盖玻片可以改变胚胎的方位。

本节附录：

实验试剂

1)    cDNA or genomic DNA

2)     PCR master mix (Promega, cat. No. M7505)

3)    Sterile double distilled water

4)    Trizma? base (Sigma, cat. no. T1503)

5)    Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (Eurobio, cat. no. GAUEDT00-66)

6)    Boric acid (Sigma, cat. no. B7901)

7)    Agarose (Sigma, cat. no. A9539)

8)    Transcription buffer (Promega, cat. no. P118B)

9)    DL-Dithiothreitol (DTT) (Promega, cat. no. P117B)

10) DIG RNA Labeling Mix (UTP) (Roche, cat. no. 1277073)

11)  RNAsein (Promega, cat. no. N251X)

12) T3 RNA-Polymerase (Promega, cat. no. P207C)

13) T7 RNA-Polymerase (Promega, cat. no. P207B)

14) RNAse free DNAse I ( Roche, cat. no. 776785 )

15) NaOH (Sigma, cat. no. S8045)

16) RNAlater (Sigma, cat. no. R-0901)

17)  Adult male and female zebrafish ( Danio rerio ) of comparable size and age (within the range of 3 months to 2 years old).  所有的动物实验应遵循实验动物管理规则和条例。

18) Pronase (Protease from Streptomyces griseus, Sigma, cat. no. P6911)

19) Fish water (养殖系统水)

20) Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Modified, without calcium chloride and magnesium chloride. (PBS) (Sigma, cat. no. D-5652)

21) Paraformaldehyde (PFA) (Sigma, cat. no. P-6148) 有毒试剂，使用应注意防护眼睛，避免接触皮肤，有条件的话可以穿防护服。

22) Methanol (Technisolv , cat. no. prol83809-360 )，避免吸入，避免接触到眼睛和皮肤。

23) 1-phenyl-2-thiourea (PTU) (Sigma, cat. no. P7629) 高毒试剂，吞入或吸入可致命或造成严重后果。使用时避免散入周围环境中。

24) NaCl (Sigma, cat. no. S3014)

25) KCl (Sigma, cat. no. P9541)

26) MgSO4 (Sigma, cat. no. M2643)

27) Ca (NO3)₂ (Sigma, cat. no. C1396)

28) HEPES (Sigma, cat. no. H3375)

29) H2O2 (Sigma, cat. no. 31642)

30) KOH (Sigma, cat. no. P1767)

31) Tween20 (Sigma, cat. no. P-1379)

32) Proteinase K (Roche Diagnostics, cat. no. 1092766) ，母液浓度为10 mg/ml，使用PBT溶解，分装成100 μl每份，存于-20°C。使用终浓度为10 μg/ml.

33) Formamide high purity grade (Carlo Erba, cat. no. 452286)

34) Serdolit MB-3 (Serva, 40721)

35) Citric acid trisodium salt (Sigma cat. no. C3674)

36) Citric acid monohydrate (Sigma, cat. no. C1909)

37) Heparin sodium salt (Sigma, cat. no. H-3393)

38)  tRNA from wheat germ Type V, lyophilized powder  (Sigma, R7876)

39) Phenol solution Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 (Sigma, P4682)

40) Chloroform (Carlo erba, cat. no. 438603)

41) Sodium acetate (Merck, cat. no. 0095096B)

42) Ethanol absolute (Technisolv, cat. no. PROL83813-360)

43) Sheep serum ( Interchim SA, cat. no. 013-000-121). 使用无菌水配制，分装成小管，保存于-20°C

44) Albumin from bovine serum, further purified Fraction V, 99% pure (BSA) (Sigma, A3059)

45) Sheep anti Digoxigenin-AP Fab fragments (Roche Diagnostic, cat. no. 1093274)

46) HCl (Sigma, cat. no. H1758)

47) MgCl2 (Sigma, cat. no. 63068)

48) Nitro Blue Tetrazolium (NBT, Sigma, N6639). 将50 mg的Nitro Blue Tetrazolium溶于0.7 ml N, N-dimethylformamide 和0.3 ml无菌水中，保存于-20°C。

49) 5-bromo 4-chloro 3-indolyl phosphate (BCIP, Sigma, B-8503). 将50 mg的5-Bromo 4-Chloro 3-Indolyl Phosphate 溶于1 ml 的无水N, N-dimethylformamide，保存于-20°C.

50) N, N-Dimethylformamide anhydrous, 99.8% (Aldrich, cat. no. 227056)

51) Na2HPO4, 12H2O (Fluka, 71650)

52) NaH2PO4 (Merck, cat. no. 1,06346,1000)

53) Glycerol ≥99% (Sigma, G6279)

溶液配方

1)    10 x PBS pH5.5 stock solution: 将10.8 g Na2HPO4, 65 g NaH2PO4, 80 g NaCl, 2 g KCl 溶于IL水中，调节PH至5.5，灭菌备用。

2)    PBT: 1 x PBS, 0.1% Tween20 (vol/vol)

3)    Stop solution: 1 x PBS pH5.5, 1mM EDTA, 0.1% Tween 20 (vol/vol)

4)    20x SSC stock solution: 将NaCl 175.3 g, Citric acid trisodium salt 88.2 g溶于IL水中，灭菌备用。

5)    Blocking buffer: 1 x PBT, 2% sheep serum (vol/vol), 2mg/ml BSA.

6)    0.3 x Danieau medium: 17 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.12 mM MgSO4, 1.8 mM Ca(NO ₃ ) ₂ , 1.5 mM HEPES, pH 7.6

7)    Alkaline Tris buffer: 100 mM Tris HCl pH 9.5, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 0.1% Tween 20

8)    1 x TBE: 将12.1 g Trizma? base, 0.75 g EDTA and 7.6 g Boric Acid溶于IL水中。

9)    EDTA 0.5M pH 8.0: 将186.1 g EDTA-Na盐溶于800 ml水中，加入大约15 g NaOH 固体调节PH至8.0，定容到1L。

10) Pronase preparation: 将1 g of Protease溶于100 ml 0.3 x Danieau buffer，37°C水浴2小时充分溶解，分装成5 ml每管，保存于- 20°C。

11) 4% (wt/vol) paraformaldehyde in 1 x PBS: 将4 g paraformaldehyde 溶于1x PBS，加热直至所有粉末溶解，冷却到室温。可保存于室温下，使用2周左右。PFA容易降解，不宜反复加热，使用过程中会因甲醛的形成而呈酸性。

12) 20% Tween20: 将200 ml Tween20溶于800 ml无菌水中，充分溶解后，可避光保存于室温下。

13) RNAse free tRNA: 将tRNA配制成50 mg/ml，使用酚/氯仿抽提以去除蛋白质杂质。

14) Hybridization Mix (HM): 50% 去离子 Formamide, 5 x SSC, 0.1% Tween20, 50 μg/ml Heparin, 500 μg/ml RNAse Free tRNA，使用柠檬酸调节pH 至6.0 with (50 ml HM大约加460 μl 1M柠檬酸即可).

15) Deionization of Formamide: 将优质的formamide加入到10 g/l Serdolit MB-3中，慢慢搅匀大约15 min，重复一次，过滤以去除树脂，避光保存于4°C.

16) Tris HCl pH 9.5, 1M stock solution: 将121.1 g of Trizma? base溶于900 ml水中，使用HCl调节pH至9.5，定容到1L。

17) Labeling solution: 20 ul NBT-BCIP混合液加入到 1 ml alkaline tris buffer中混匀即可。

设备

1)    SigmaSpin Post Reactions Purification Columns (Sigma, cat. no. S-5059)

2)    Breeding tanks with dividers diagonal

3)    Dissecting stereomicroscope with diascopic stand and a fiber optic illuminator with articulated arms.

4)    Pipette pump filler (Fisher, cat. no. 13-683C)

5)    Pasteur capillary pipette 15 cm (VWR, cat. no. 612.1701)

6)    Pasteur capillary pipette large diameter (diameter of the capillary 2 mm) (Dominique Dutscher S.A. - cat. no. 042000L)

7)    Incubator (28.5°C)

8)    Small baskets

9)    Multiwell 6 well plates

10) Multiwell 24 well plates

11) Water bath with agitation

12) Styrofoam float

13) Horizontal orbital shaker (VWR, cat. no. 47742-752)

14) Spot plates in white porcelain, 12 cavities (Fisher, cat. no. S337241)

15) Single end frosted microscope slides 75 x 25 mm, thickness 1 mm (VWR, cat. no. 16004-368)

16) Micro cover glasses square (22 x 22 mm) thickness 1 ? (VWR, cat. no. 48366-227).

17) Micro cover glasses rectangular (24 x 40 mm) thickness 1 (VWR, cat. no. 48393-060)

18) Super glue (cyanoacrylate) (Fisher, cat. no. 11-999-24)

19) Macroscope

20) Compound microscope with Differential Interference Contrast (DIC) Digital camera linked to a PC.

21) Imaging software

22) Agarose-coated Petri dishes:   用于脱膜胚胎饲养，平皿中倒入溶解好的2% 琼脂溶液，大约2 mm厚度。

 

 

第五节 原位杂交常见问题

常见问题	可能原因	解决方案
RNA合成浓度低	使用SP6 RNA聚合酶，整合DIG标记的UTP效率低下	使用T7或T3 RNA聚合酶
RNA电泳条带拖尾	合成过程中使用的试剂和耗材没有做到RNAse-free	操作过程中注意RNAse-free
胚胎脱膜不完全或破碎	链霉蛋白酶pronase使用浓度不当或处理时间不当。 pronase失效。	选择合适的pronase浓度,掌握好处理时间
胚胎破碎	蛋白酶 K 处理太过	严格控制好蛋白酶K处理的浓度和时间
	胚胎固定问题	最好用新鲜配制的4%PFA溶液进行固定, 控制好固定时间
	吸取胚胎用力过猛	胚胎操作, 动作一定要轻柔
染色背景过高	杂交温度太低	RNA-RNA杂交温度最好为65?C, 严格控制杂交温度
	清洗不彻底	保证清洗所需的时间及温度
	杂交液中的甲酰胺质量欠佳	使用优质产品
染色呈蓝绿色	探针浓度过高	将探针稀释至合适浓度
无染色	探针合成问题或探针降解	探针合成后一定要跑电泳检测探针合成的质量
	基因表达时间与胚胎时期不一致	用RT-PCR 检测基因表达时间
染色只在表面	PFA固定时间太长或固定温度过高	最好用新鲜配制的4%PFA溶液进行固定, 控制好固定时间和温度
	胚胎发生黏连	控制好蛋白酶K处理时间, 遇到黏连情况应及时将胚胎轻轻吹散开
胚胎变成粉或棕色	曝光过度	胚胎应避光染色，染好色后应避光保存