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常见荧光蛋白简介

作者:Xie xunwei 发布时间:2015/11/30 5:00:00

1.   荧光蛋白的研究历史

    2008年度诺贝尔化学奖授予美国科学家下村修(Osamu Shimomura)、马丁.查非(Martin Chalfie)和钱永键(Roger Y. Tsien),以表彰他们在生物荧光方面所做的突出贡献。下村修首次分离纯化了水母素和绿色荧光蛋白。马丁.查非展示了绿色荧光蛋白作为各种生物现象的亮光基因标签的科研价值。而钱永键极大地方便了绿色荧光蛋白技术的应用,解释了其机制,并发现了很多新的从红到蓝的顔色和相应的应用工具。

    1962年,下村修和约翰森等在《细胞和比较生理学杂志》上报道了他们从水母(Aequorea victoria)中分离纯化了发光蛋白水母素。第二年,他们在《科学》杂志上发表了钙和水母素发光的关系的研究成果。Ridgway和Ashley利用水母素来检测钙浓度,同时水母素可以指示钙的空间分布,目前该方法仍在延用。1974年,下村修和约翰森纯化了绿色荧光蛋白(GFP)。Morin和Hastings发现水母素和GFP之间可以发生能量转移,水母素在钙刺激下发光,其能量可转移到GFP并刺激GFP发光,即生物中发生的荧光共振能量转移(FRET)现象。

    1985年,普腊石和Satoshi Inouye根据水母素的蛋白质序列得到了水母素的基因序列,6年后拿到了GFP的基因序列。而GFP在其他生物体中的表达始于1994年,水母素也有相应重要的应用。水母素属于荧光酶的一种,它的发光需要底物荧光素,钙离子的存在可以促进发光反应的进行。而GFP蛋白质本身就可以发光。

2.   绿色荧光蛋白的发光机制

    GFP基因由3个外显子组成,编码形成一个由238个氨基酸残基组成的单链多肽,分子量为27 KD。GFP的荧光发射峰位于509 nm,最大激发波长为395 nm,并于470 nm处有一肩峰。GFP通常以二聚体的形式存在,形成一个内含一个α-螺旋和外面包围11个β-折叠链的β-桶状结构。这些β-折叠彼此紧密结合,和α-螺旋组成一个单独的致密结构域,没有可供扩散的配体进入的缝隙,这种坚实的结构保证了其稳定性、抗热性和抗变性剂等的特点,同时也说明了其生色基团只能自身环化,而非外源酶催化的原因。GFP的生色基团由位于第65-67位的3个氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成的对羟基苯咪唑啉酮构成,通过tyr66的脱质子状态和质子化状态的转换来决定荧光发射。生色基团在蓝光照射下,会吸收蓝光的部分能量,进入脱质子状态并发射出绿色荧光。

    GFP具有众多优点,由于其本身可以被光激发而发光,故其应用不需加任何底物,荧光性质稳定。GFP只有27 KD,相对分子量小,并对细胞没有毒性。GFP没有种属特异性,没有假阳性干扰,灵敏度高,易于检测。GFP在生命科学领域的应用很广泛,最常见的是作为报告基因构建基因工程载体。例如将目的基因与GFP基因连接后,可通过观测融合蛋白的荧光特性来研究目的基因的表达和功能。如果将某种特定细胞利用GFP标记,就可以追踪该种细胞的生长动态过程。同时,如果将某种病原体标记上GFP,通过观察其在宿主内的运动方式和表达时间,可以研究该病原体与其宿主的关系。

    钱永键于1994年开始研究GFP,他在下村修与查非的基础上进一步阐明了GFP发光的化学机制,并通过改变其氨基酸排序,造出能吸收、发出不同顔色光的荧光蛋白,包括蓝色、青色和黄色。其他研究人员又相继从珊瑚和海葵等中克隆了光谱红移的荧光蛋白基因。多色荧光蛋白技术使用科学家可以同时跟踪几种不同的生物过程,极大的促进了科学的发展。1995年,Heim等人将GFP上的Ser65点突变为Thr或Cys,荧光强度提高了4-6倍。此后的研究中用到的GFP突变体都是在此基础上通过改变若干碱基得到的。但要注意的是,GFP具有紧密的蛋白结构,可以抵抗pH变化,温度改变和变性剂的作用,而衍生的突变体多少会破坏其本身的结构,导致其对外界环境变化更加敏感。

3.   常见荧光蛋白简介

    以GFP为蓝本通过基因技术合成的突变体发射光谱涵盖了整个可见光波段,近几年针对荧光蛋白的改造工作主要集中于提高荧光蛋白的亮度,改变Stokes位移(指激发峰与发射峰之间的距离)和光谱特性,以及寻找新型光转换/光激活荧光蛋白等方面开展。下面介绍几种较为常用的绿色/红色荧光蛋白基因及发光特性。

    mGFP5:将野生型GFP的ser65替换为thr,荧光强度较野生型的GFP提高了4-6倍。GFP的激发光波长与紫外线区较为接近,对光学要求较高,并且对生物有较大的毒害作用,不适宜作活细胞观察。改造后的mGFP5的激发光波长提高到488 nm,位于青色区域,有效避免了上述缺点。目前这一突变体已被EGFP替换。国家斑马鱼资源中心(China Zebrafish Resource Center, CZRC)目前保存有转基因品系CZ29 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ29)使用的mGFP5报告基因。

    EGFP:在mGFP5的基础上将Phe64替换为Leu,得到的GFP突变体命名为EGFP。EGFP的生色团在37℃的荧光得到了很大的提高,荧光强度较野生型GFP提高了35倍,并且在激发后16-24小时后仍可稳定地检测到。当然,EGFP也有相应的缺陷,对pH较为敏感,易于二聚化。EGFP目前仍然是最常用的绿色荧光蛋白,本中心保存有大量的使用EGFP作为报告基因的转基因品系,如CZ17 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ17)、CZ36 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ36)、CZ61 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ61)等,均表现出较强的荧光表达模式。

    D2EGFP:在EGFP的C端加入422-461氨基酸残基的小鼠鸟氨酸脱羧酶(MODC,mouse ornithine decarboxylase),得到一个不稳定的EGFP变体。MODC的422-461氨基酸残基区包含一个PEST序列,靶定目的蛋白降解,d2EGFP只有2小时的半衰期。目前本中心保存有一个使用D2EGFP作为报告基因的转基因品系CZ25 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ25),由TOP启动子驱动其表达。

    多色GFP变体:将接近GFP生色团的Thr203突变为Trp后,可以将激发光和发射光的波长均增加20 nm,再进一步改造为黄色荧光蛋白EYFP。如果将GFP生色团中的Tyr66突变为His后得到蓝色和青色荧光蛋白变体BFP/CFP。这些变体或存在光漂白现象,或荧光强度不高,或对pH变化敏感等缺陷,需要进一步的改进优化。

    橙/红色荧光(560-650 nm)可以较好的与共聚焦显微镜和宽视场显微镜兼容。橙/红色荧光蛋白对于活体生物成像具有很好的应用前景,机体组织内的血红素在可见光波段有强吸收,而水与脂肪在红外波段有强吸收,在近红外光波段(650-900 nm)的吸收系数最小且自发荧光最弱。此外基于其较长的激发光波长,对细胞毒性较小,可以用于检测较深的组织。最早应用的橙色荧光蛋白是从一种热带珊瑚(Discosoma striata)中分离得到的,命名为DsRed。DsRed的激发光主峰值为558 nm,次要峰值为500 nm附近,荧光发射光波长为583 nm。DsRed成熟时间较长,易形成四聚体,阻碍了它的应用。本中心保存的使用DsRed1作为报告基因的转基因品系不多,如CZ65 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ65),荧光特性不如EGFP好。

    DsRed2:将DsRed的多肽氨基末端进行突变改造得到的荧光蛋白突变体DsRed2,减少了蛋白凝集作用,降低了细胞毒性,同时荧光蛋白的成熟时间也变短了。DsRed2依然会形成四聚体,由于成熟时间变短,在多色荧光实验中可以更好地和GFP结合使用。DsRed2相对一代DsRed应用略广泛,本中心目前保存的CZ70 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ70)即使用的DsRed2作为报告基因。

    DsRed-express:在DsRed2基础上进一步改造得到的,成熟时间进一步变短,荧光强度也得到了增强。DsRed的红色荧光要在表达后11小时才可以观察到,DsRed2缩短为6小时,而DsRed-express则只要1小时。遗憾的是,DsRed-express的易聚集为四聚体问题仍未得到解决。本中心目前保存有使用DsRed-express作为报告基因的转基因品系CZ69 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ69),由sox17启动子驱动其表达,可以有效地标记内胚层。

    mRFP1:第一代单体红色荧光蛋白mRFP1是通过改造DsRed的33个残基而来,激发光波长为584 nm,发射光波长为607 nm。同其他荧光蛋白衍生物一样,mRFP1也表现出明显的荧光发射减弱和光漂白现象。本中心中保存有CZ27 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ27)转基因品系,由母源性启动子zp3作用的cre激活品系与krt4启动子作用的loxP效应品系杂交得来,泛表达红色荧光。

    mCherry:通过对mRFP1的发色团残基进行点突变获得新的荧光蛋白,以相应的水果名字来命名为mCherry,发射峰位于610 nm。mCherry成熟快,单体特性好,光稳定性较强,但亮度偏低。本中心保存的CZ72 (http://www.zfish.cn/Products/ProductDetail.aspx?CZRCID=CZ72)转基因品系在前胰岛素原(preproinsulin)启动子驱动下稳定表达mCherry报告基因。

    Kaede:从石珊瑚Lobophyllia hemprichii中克隆得到的,其在紫外光照射下,发射能从绿色(518 nm)变为红色(580 nm)。Kaede是光转换蛋白中的一种,具有一个能发出绿色荧光的由三肽His-Tyr-Gly发色团,它的荧光转换是由于紧邻发光团H62上的肽键发生断裂而引起的。Kaede在斑马鱼中常用来作为研究细胞运动的标记基因,如标记原肠期的囊胚细胞研究汇聚延伸运动。Kaede易形成四聚体,限制了其在蛋白标记与超分辨成像方面的应用。

    荧光蛋白的研究为生命科学提供了不可或缺的研究手段,目前在活体成像深度上仍有待进一步发展,需要不断改良优化新的亮度高的单体近红处/红色荧光蛋白分子。新特性的荧光蛋白,如光转换与光活化荧光蛋白、大strokes位移的荧光蛋白等的开发也将为光学成像技术带来新的突破,有效地提高成像的时空分辨率和灵敏度。


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