杜久林/施剑林合作开发近红外电压纳米探针用于在体监测神经元电活动

监测活体动物的群体神经元电活动，是解析神经系统功能机制的关键。光学监测方法比电生理学手段更适合长时间稳定记录大范围的群体神经元活动。在斑马鱼小巧透明的脑中进行光学监测，更充分发挥了其在系统神经科学研究中的优势，此前杜久林研究组开发了对全脑范围任意神经元集群进行光学调控，同时记录全脑神经元活动和斑马鱼行为的成像与调控系统【1】。目前，光学监测所应用的探针主要是GCaMP等钙离子浓度敏感的荧光蛋白。然而，相比于电活动，钙离子浓度变化的动力学相对较慢，且很难从中推断出与之对应的神经脉冲的频率和数量。因此，神经科学界亟需直接反映细胞膜电位变化的纳米粒子或荧光分子探针，从而实现灵敏、高信噪比、高时空分辨率的大范围神经元集群活动监测。现有的电压探针多是基于荧光蛋白开发的，局限于紫外或可见光激发，因该波段在活体组织中易于吸收和散射，所以只能应用于大脑浅层；这些探针的信噪比偏低、淬灭较快，进一步限制了其应用于实际研究。相比于可见光或紫外光，红外光（750 nm - l000 nm）在生物组织中穿透能力更强，穿透深度可达厘米量级，被称为“生物组织的光学窗口”。因此，发展高灵敏性并可用近红外光激发的电压敏感探针已成为目前国际神经科学领域重点攻克的技术难关之一。

2020年4月7日，中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（中科院神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杜久林研究组与中国科学院上海硅酸盐研究所施剑林研究组在《美国化学会志》发表了题为《近红外电压纳米探针用于实时监控小鼠和斑马鱼神经活动》的研究论文，报道了一种可用近红外光激发的电压荧光纳米探针。应用该探针，成功监测了斑马鱼和小鼠脑中神经元膜电位的动态变化【2】。

图1：电压纳米探针的设计及其感应机理。首先，UCNPs固定在神经元细胞膜上。其次，将六硝基二苯胺（DPA）嵌入细胞膜磷脂双分子层。在神经元静息状态下，带负电荷的DPA在细胞膜外侧富集，UCNP与DPA之间形成发光共振能量转移体系（FRET），UCNPs发光被DAP吸收，检测到的光信号弱。当神经元去极化后，DPA在电场作用下在细胞膜内侧富集，FRET效应减弱，从而恢复UCNPs的发光。

该探针是基于上转换纳米颗粒和发光共振能量转移机制开发的。稀土元素掺杂的上转换纳米颗粒（UCNPs）是一类近红外光激发，发射紫外、可见光的反斯托克斯发光纳米材料。由于组织穿透深、背景荧光低、多重发射，已在生物成像与活体诊疗中获得广泛应用。在此次工作中，研究人员设计和制备了一种基于UCNPs的电压敏感探针。首先利用GSH多肽将UCNPs固定在细胞膜上，然后将六硝基二苯胺（DPA）嵌入细胞膜磷脂双分子层。在细胞静息状态下，带负电荷的DPA在细胞膜外侧富集，UCNP与DPA之间距离在10 nm以内，因此形成发光共振能量转移体系（FRET），UCNPs发光被DAP吸收，导致可检测的光信号较弱。当细胞去极化后，DPA在电场作用下富集到细胞膜内侧，UCNP与DPA之间距离超过10 nm，FRET效应消失，从而恢复可检测的光信号。

神经元的电活动具有丰富的动态性，而以往基于荧光蛋白开发的电压探针由于信噪比较低，大都需要平均多次才能得到清晰的感觉反应。同时此类探针的荧光容易淬灭，因此可记录时间较短，严重限制了其实用性。应用新开发的电压纳米探针，研究人员监测了斑马鱼前脑神经元对食物刺激的反应。在近红外光激发下，单次施加该食物刺激即可显著增强神经元的荧光信号，分辨出有食物反应的神经元的空间分布，并可在连续数次刺激下稳定记录而不表现出明显的信号衰减。得益于UCNPs较低程度的淬灭，活体记录时间可长达30分钟。

图2：电压荧光纳米探针检测到斑马鱼前脑神经元对食物刺激的反应

该工作为设计为开发近红外光纳米探针提供了全新思路，为探究深层活体组织中神经活动开辟了实时动态监测的新方法。近期，两个研究组利用UCNPs，还合作开发了用于检测大脑中随神经活动改变而动态变化的钾离子浓度的近红外光纳米探针【3】。

中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（中科院神经科学研究所）、上海脑科学与类脑研究中心、神经科学国家重点实验室杜久林研究员与中国科学院上海硅酸盐研究所施剑林研究员、步文博研究员为共同通讯作者。博士后刘佳男、副研究员张荣伟、尚春峰为共同第一作者。张俞、许兵、冯芸为这项工作做出了重要贡献。

原文链接

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.0c01025

参考文献

1. Jiao, Z.F.^#, Shang, C.F.^#*, Wang, Y.F.^#, Yang, Z., Yang, C., Li, F.N., Xie, J.Z., Pan, J.W., Fu, L.*, and Du, J.L.* (2018). All-optical imaging and manipulation of whole-brain neuronal activities in behaving larval zebrafish. Biomedical Optics Express 9(12): 6154-6169.

2. Liu, J.N.^#, Zhang, R.W.^#, Shang, C.F.^#, Zhang, Y., Feng, Y., Pan, L.M., Xu, B., Hyeon, T., Bu, W.B.*, Shi, J.L.*, and Du, J.L.* (2020). Near-infrared voltage nanosensors enable real-time imaging of neuronal activities in mice and zebrafish. Journal of the American Chemical Society 142(17):7858-7867.

3. Liu, J.N.^#, Pan, L.M.^#, Shang, C.F. ^#, Lu, B., Wu, R.J., Feng, Y., Chen, W.Y., Zhang, R.W., Bu, J.W., Xiong, Z.Q.*, Bu, W.B.*, Du, J.L.*, and Shi, J.L.* (2020). A highly sensitive and selective nanosensor for near-infrared potassium imaging. Science Advances 6: eaax9757.