Science突破丨孟安明/陶庆华组合作发现“葫芦娃”基因，解决早期胚胎发育重大问题—专家解读点评

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动画片《葫芦娃》中的卡通形象

11月23日，清华大学孟安明老师实验室与陶庆华老师实验室合作在Science上在线发表了题为Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates的重量级文章（RESEARCH ARTICLE），文章发现母源因子huluwa （葫芦娃）可通过稳定β-catenin信号诱导脊椎动物胚胎背侧组织中心和体轴的形成，这一工作是孟老师实验室几十年关注胚胎早期发育的众多文章中，又一很可能改写教科书的重要发现。

图1. A. 汉斯·斯佩曼和他的学生希尔德·曼戈尔德；B. 蝾螈移植实验：从无色素的蝾螈胚胎背侧移植至一个有色素的蝾螈腹侧；C.接受“组织中心”移植后的蝾螈长出第二个体轴。【2, 3】

体轴（包括前-后、背-腹和左-右）的建立是生物个体图式建成的基础，也是胚胎早期发育过程中最重要的事件之一；其中背-腹轴的研究可以追溯到上世纪初，德国科学家汉斯·斯佩曼（Hans Spemann，1869～1941）和他的学生希尔德·曼戈尔德(Hilde Mangold, 1898～1924)利用蝾螈进行的移植实验（图1），他们发现当把蝾螈背侧的一部分组织移植至腹侧时，蝾螈被诱导出了第二个体轴，并且第二个体轴不仅含有供体细胞（无色素），也含有受体细胞（有色素），其他部位的组织并无此特性，因此他们把这部分组织称为“背侧组织中心”（Dorsal Organizer），斯佩曼也因此获得1935年的诺贝尔生理学奖（很遗憾曼戈尔德因于1924年去世未能获奖）【2, 3】。

“背侧组织中心”如何形成因此成为背腹轴建立中的一个重要问题，吸引了全世界一代又一代发育生物学研究者的注意。目前公认的观点是β-catenin信号在胚胎背侧的稳定、富集并进入细胞核内激活了一系列信号通路，最终激活组织中心基因如Chordin, Noggin和Goosecoid等的表达（图2，A）；但母系来源的β-catenin如何特异地在背侧被稳定仍存在一定的争议： 一种观点认为，卵子的植物极存在母系来源的Disheveled (Dsh)、GSK3-bingding protein (GBP)以及Wnt等蛋白，受精后这些分子会迁移至精子进入卵子位置的对侧，从而防止β-catenin的降解【2, 4, 5】（图2，B），诱导“背侧组织中心”的形成，但也有报道称某些母系Wnt的突变体并未观察到明显早期背侧发育的问题【6】。

图2. A. 背侧组织中心的形成依赖于β-catenin在背侧的稳定；B. β-catenin在背侧被稳定并激活的经典模型，依赖于Dsh、GBP以及Wnt信号。【2】

在该工作中，研究人员通过一个斑马鱼突变系 -“Huluwa”入手，在斑马鱼和爪蟾两种模式生物中均证明了β-catenin在背侧被稳定的另外一种全新的机制。这个突变体在受精后24小时左右形状酷似葫芦（图3，A），因此，起初孟老师实验室幽默的称其为“葫芦”突变体，后改名为“葫芦娃”，当问及孟老师为何改名时，他风趣的开玩笑说90年代初刚回国时陪孩子看动画片“葫芦兄弟”，印象深刻，觉得“葫芦娃”比“葫芦”厉害，因此改名为“葫芦娃”。文章中也可以看到，作者们很认真的提供了动画片“葫芦娃”的维基百科链接（图3，B），这应该是第一个以中国动画人物命名的斑马鱼突变体，必须点个赞。

图3. A. “葫芦娃”突变体呈葫芦状；B. 动画片“葫芦兄弟”的维基百科网页。【1】

“葫芦”形状的斑马鱼突变体是一种典型的严重“腹侧化”表型，因此作者推断这个突变体很可能是影响了一个决定背侧组织中心形成的重要基因，并将该基因定位于斑马鱼基因组第21号染色体，是一个母系来源的跨膜蛋白，命名为huluwa（简称“hwa”）。为了进一步证明其功能，作者把hwa的mRNA在32个细胞期分别注射在其中的两个细胞，发现hwa成功诱导出了两个斑马鱼的“背侧组织中心”和两个体轴（图4），并在爪蟾中证明hwa具有相同的功能。

图4. 32细胞期在两个细胞中分别注射hwa 的mRNA可诱导出两个组织中心及两个体轴。【1】

如前所述，β-catenin信号对背侧组织中心的形成起到重要的诱导作用，为了验证hwa是否通过β-catenin信号行使其诱导背侧组织中心的功能，作者证实在“葫芦娃”突变体中注射hwa的mRNA可检测到β-catenin在细胞核内的信号，并利用持续激活型的β-catenin可一定程度恢复“葫芦娃”突变体的腹侧化表型；更重要的，当β-catenin信号被沉默时，hwa不能再诱导背侧组织中心的基因如boz和chd的表达（图5），综上可以说明，hwa对于背侧组织中心的诱导作用依赖于β-catenin信号。

图5.  背侧组织中心基因在β-catenin敲低的胚胎中无法被hwa诱导表达。【1】

接下来，作者发现在“葫芦娃”突变体中，之前报道的影响背侧组织中心形成的Wnt信号通路的相关成员如：wnt8a, β-catenin2, axin1, axin2, dvl2, lrp5, lrp6, fzd3b, fzd5, fzd7b, andfzd8b等基因的mRNA表达水平并没有变化，证明即使是这些信号正常的情况下，如果hwa发生突变，背侧组织中心仍然不能形成；非常重要的是，在通过各种方式抑制Wnt信号的情况下，hwa仍然能够诱导背侧组织中中心的形成（图6），这充分证明了hwa的功能不依赖于Wnt信号通路，作者也证明了在爪蟾中存在相似的情况。如果不是通过Wnt信号通路，那么hwa是如何让β-catenin稳定不被降解？Axin是已知的促进β-catenin蛋白降解的重要因子，作者进一步的通过一系列的体内体外生化实验，证明Hwa可以通过与Axin直接结合促进其降解，而最终使β-catenin在背侧稳定表达。最终的机制见图7的模式图，可以看到，图中作者们用了葫芦的形状来代表Hwa。

图6. 抑制Wnt信号不影响hwa对背侧组织中心的诱导功能。【1】

图7. Hwa对背侧组织中心诱导作用模式图。【1】

综上便是“葫芦娃”如何通过与Axin结合使其降解，从而保护β-catenin，并诱导背侧组织中心形成的故事，孟安明老师实验室与陶庆华老师实验室合作报道了一种不依赖于Wnt信号通路诱导组织中心形成的机制，对背腹决定这一古老而又重要的发育生物学问题为我们提供了一种全新的理解，对现有的教科书中的经典模型提出了挑战。此外，如作者们在文章中提到的那样，“葫芦娃”是否需要其他的分子协助其发挥作用，其迁移以及作用的具体机制是什么，还有待更进一步的研究，我们期待“葫芦娃”的续集更加精彩。

据悉，孟安明院士和陶庆华教授为该项研究的共同通讯作者，清华大学生命学院博士生晏璐、博士后陈静和朱薛辰为共同第一作者。

专家点评

冯新华（浙江大学生命科学研究院，院长、教授）

胚胎发育的研究最早可追溯至公元前，古希腊学家亚里士多德通过对鸡胚和一些无脊椎动物胚胎系统的观察和解剖分析描述了受精和胚胎发育的过程，首先提出胚胎是由简单到复杂逐渐发育而成的。直到十九世纪巴斯德和二十世纪初Hubrecht的研究才使我们对胚胎发育有了较为详尽的了解，但是他们的研究依然只是停留在描述性的阶段。上世纪80-90年代，科学家在果蝇上的研究发现，未来躯体的头尾轴线和背腹轴线信息，早期存在于受精前的卵子中。但是，脊椎动物的头尾轴线和背腹轴线是否以及如何由储存在卵子中的母源因子调控，仍不太确定。

在新的一期Science中，清华大学孟安明教授及其团队与陶庆华教授的团队合作，长文报道了一个新的母源基因并揭示了它在胚胎发育中的关键作用。文章描述了在实验过程中发现的一个新的斑马鱼母源突变体，因其突变体表型酷似葫芦、且中国动画片《葫芦兄弟》中七弟的葫芦具有消化任何物质的能力，而被命名为huluwa（hwa）（葫芦娃）。

无论从形态上或胚层发育相关标记基因的表达上来看，虽然hwa母源突变体胚胎在卵裂和囊胚阶段都可正常发育，但它在原肠早期缺乏背部组织中心，即不能形成胚盾，导致不能形成头部、神经系统及躯干，仅有残留的尾部组织。利用遗传学方法他们发现突变体中hwa基因的启动子中插入的一段DNA破坏了其表达；其进一步的研究发现该基因编码了一个全新的跨膜蛋白，该蛋白能够通过激活β-catenin促进胚胎背部发育。β-catenin是脊椎动物体轴形成过程中重要的转录因子，其通常受到Wnt信号激活。在Wnt信号通路中，Wnt配体与受体（Frizzled和LRP5/6）结合后将激活下游通路，抑制GSK-3β激酶并促成抑制蛋白Axin的降解，从而释放β-catenin并提高该蛋白在细胞内的稳定性，进而激活下游靶基因的表达。那Hwa又是如何激活β-catenin的呢？实验证明，Hwa能够通过降解Axin从而激活β-catenin。更为有趣的是，Hwa对β-catenin的激活并不依赖于Wnt配体和受体。该研究为我们打开了胚胎发育研究的新大门，但依然留给大家许多未解之谜。例如，hwa作为母源基因，其蛋白产物仅分布在囊胚未来背部区域细胞的质膜上，这种不对称分布是如何实现的？另外，理论上Hwa在进化中应该趋于保守，本研究也初步验证了Hwa在爪蛙中的类似功能，但是通过序列对比尚未发现哺乳动物中的hwa同源基因，那么哺乳动物是否具有与hwa序列不保守但功能相似的基因呢？这些问题都尚有待进一步探索。总的来说，这项工作是分子遗传学和发育生物学研究完美结合的产物。

刘峰（中科院动物所研究员，杰青）

脊椎动物体轴的建立是胚胎发育过程中的重要事件，其中背部组织中心是建立正确的胚胎图式形成（embryonic patterning）和原肠运动的关键。母源信号通路是背部组织中心形成的关键因素，通过激活Chordin、Noggin等Bmp信号抑制因子在背部表达和分泌，拮抗来自腹部的BMP 信号，形成一定的浓度梯度，从而指导胚胎背腹轴的建立。

之前的研究普遍认为β-catenin是依赖于母源WNT受体配体信号发挥作用的，清华大学孟安明院士和陶庆华实验室的这个合作工作颠覆了以往的观点。他们发现了一个新的母源基因huluwa（中文名：葫芦娃，是中国著名动画片《葫芦兄弟》的主角），其缺失后导致斑马鱼背部组织中心以及体轴无法正常形成，斑马鱼胚胎呈现葫芦形状（这也是他们把该基因及突变体命名为“葫芦娃”的原因）。Huluwa过表达导致胚胎背部化并具备诱导第二体轴的能力，其分子机制是通过促进β-catenin降解的关键因子Axin下调，进而维持β-catenin的水平。此外，Huluwa的这一作用及其调控机制在非洲爪蟾胚胎体轴发育中也是保守的。

孟安明院士的合作研究鉴定了脊椎动物胚胎体轴形成中的关键调控因子，揭示一个新的WNT配体-受体非依赖调控机制，是教科书级别的发现。

参考文献

1. Lu Yan, Jing Chen, Xuechen Zhu, Jiawei Sun, Xiaotong Wu, Weimin Shen, Weiying Zhang, Qinghua Tao, Anming Meng. 2018. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science.

2. Gilbert & Barresi. Developmental Biology, page 333-378. 11th edition.

3. Spemann, H. and H. Mangold. 1924. Induction of embryonic primordia by implantation of organizers from a different species. (Trans. V. Hamburger.) In B. H. Willier and J. M. Oppenheimer (eds.),Foundations of Experimental Embryology. Hafner, New York, pp. 144–184. Reprinted in Int. J. Dev. Biol. 45: 13–311.

4. Langdon, Y. G. and M. C. Mullins. 2011. Maternal and zygotic control of zebrafish dorsoventral axial patterning. Annu. Rev. Genet. 45: 357–377.

5. Larabell, C. A. and 7 others. 1997. Establishment of the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos is presaged by early asymmetries in β-catenin which are modulated by the Wnt signaling pathway. J. Cell Biol. 136: 1123–1136.

6. Hino H. and 7 others. 2018. Roles of maternal wnt8a transcripts in axis formation in zebrafish. Dev Biol. 2018 Feb 1;434(1):96-107.

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