Nature突破｜潘巍峻组活体解析造血干祖细胞归巢的时空规律及分子细胞机制—专家点评

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责编丨迦    溆
点评丨李凌衡（Stowers医学研究所）

           刘    兵（军事医学科学院）

           陈良怡（北京大学）

正常成人体内每升血液中有10¹²数量级的红细胞为人体运输营养物质和氧气，10⁹白细胞发挥免疫功能，10⁹血小板参与止血凝血。同时，人体内血液的新陈代谢相当旺盛，正常成熟的红细胞平均寿命为120天、白细胞约7-14天、血小板约7-9天。单细胞骨髓移植实验证实，数量如此庞大的血细胞均来源于造血干祖细胞（Haematopoietic Stem and Progenitor Cell，HSPC）。

哺乳动物发育过程中，HSPC产生于主动脉-性腺-中肾区域（Aorta-Gonad-Mesonephros，AGM）的动脉血管【1,2,3】，先后定植于胎肝（进行快速增殖）和骨髓（维持成体终生造血）。HSPC在不同造血器官之间的迁移定植过程被称为归巢（homing，造血干细胞移植后需要与体内的微环境相互识别才能有效定植并发挥功能，该过程的起点统称为归巢）。生命维持高度依赖于血细胞，血细胞来源于HSPC，而HSPC正常发挥功能以其成功归巢为前提；基于这些知识，HSPC归巢的意义和重要性不言而喻。

现有的关于HSPC归巢的知识非常有限，尤其对新生HSPC归巢知之甚少。大量研究以胎生的小鼠为模式动物，无法对胎肝中HSPC归巢进行长时程活体成像，损失了时间维度的信息；而最常用的切片技术，在固定-切片操作中存在组织变形等问题，降低了空间维度信息的精准性。近年来，斑马鱼由于非常适合活体成像，成为炙手可热的模式动物。更重要的是脊椎动物中造血过程是保守的：斑马鱼中存在尾部造血组织（Caudal Hematopoietic Tissue，CHT），与哺乳动物胎肝对应；而且哺乳动物造血过程中关键的调控转录因子，在斑马鱼中都能找到同源基因。也就是说哺乳动物中可能存在与斑马鱼类似的HSPC归巢过程，活体成像的结果可能在哺乳动物中得到验证及应用。

2018年11月19日，中国科学院上海营养与健康院潘巍峻组在Nature上发表了题为VCAM-1+ macrophages guide the homing of HSPCs to a vascular niche的研究论文，通过对斑马鱼活体成像，揭示了体内新生造血干细胞归巢停留过程，并对其停留的时空规律进行解析；发现一群表达VCAM-1的巨噬细胞亚群（命名为“先导细胞”，usher cells），识别进入的HSPC并将其带入血管微环境发生长时程停留，造血干细胞随后发生增殖与分化。

潘巍峻课题组首先建立Tg（kdrl：Dendra2）光转换系统特异性标记造血干祖细胞，以itga4（integrin alpha 4 ）突变体中无法停留的HSPC行为作阴性对照，根据停留时间对野生型胚胎中出现的HSPC进行分类，定义在尾部造血组织，HSPC成功的停留，需要超过30分钟（下图）。

研究者进一步分析HSPC停留的空间分布，发现野生型胚胎中存在HSPC停留的“热点”区域，位于尾部静脉丛背侧、与节间血交汇处附近，经过精细成像和三维重构，发现热点区域存在未被报道过的特殊结构“静脉微血管”（下图）。

然而，itga4突变体中血管结构基本正常，并且也存在“静脉微血管”，HSPC为什么仍然无法正常停留呢？研究者对ITGA4的配体VCAM-1及表达VCAM-1的细胞进行了探索研究，发现血管内皮细胞散在弱表达VCAM-1的情况下，帮助HSPC在血管内皮床滚动；而一群偏圆形少伪足的巨噬细胞强表达VCAM-1，直接帮助HSPC停留。两者以迥然不同的作用机制协同促进HSPC停留在尾部造血组织（下图）。

通过抗体直标技术标记VCAM-1+巨噬细胞，结合活体实时高分辨率成像，发现VCAM-1+巨噬细胞具有巡逻行为, 引导HSPC归巢并停留在血管微环境中，因此命名为“先导细胞”（usher cells）。对于发生停留的HSPC，大约75%与VCAM-1+巨噬细胞在位于静脉丛背侧的静脉微血管的开口处相遇。在VCAM-1+巨噬细胞的指引下，部分HSPC最终能够进入静脉微血管并且停留超过120分钟，我们将这种停留方式称为“I型停留”（Type I）。另一方面，发生停留的HSPC中剩余约25%与VCAM-1+巨噬细胞在尾部静脉丛中相遇，部分发生停留HSPC会被内皮细胞形成的口袋结构（“endothelial pocket”）进行包裹，发生“II型停留”（Type II）。其他停留方式被统称为“0型停留”（Type 0），即与VCAM-1+巨噬细胞相互作用，逗留时间超过了30分钟，但是细胞间相互作用没有成功将HSPC引入到血管微环境中，这类停留一般不超过120分钟（下图）。

总的来说，该研究生动地展示了体内造血干细胞归巢停留的动态过程。值得注意的是，该研究改变了以往对VLA4-VCAM-1作用机制的认识，传统认为内皮细胞表达的VCAM-1帮助HSPC归巢停留。而该研究发现内皮细胞VCAM-1作用有限，仅帮助HSPC减速滚动；新发现的表达VCAM-1的巨噬细胞亚群对HSPC归巢停留至关重要。

图为通讯作者潘巍峻（前排中）与三位论文共同一作（后排左起分别为李美、李丹彤、薛文志）

专家点评

李凌衡（Stowers Institute for medical Research，教授）

造血干细胞产生和支持整个的血液系统，对维持所有动物生命来讲是不可或缺的。 在胚胎期，造血干细胞最早从发育中的位于背主动脉（AGM：Aorta-gonad-mesonephros）的内皮细胞转化而成。但新形成的造血干细胞要迁移到其它微环境（也叫niche, 龛）以利于其进一步扩增。在发育期的哺乳动物胚胎肝脏就起这样的微环境作用。但在其它脊椎动物例如斑马鱼的发育期， 新形成的造血干细胞在体内究竟是如何归巢仍然是个迷。在这篇文章里，潘巍峻课题组利用先进的实时成像和细胞标记系统，对于迁移的新形成的造血干细胞以及其归巢的斑马鱼的尾部造血组织 （相当于哺乳动物的胎肝）进行高分辨率分析。他们发现，表达一类粘附蛋白——VCAM-1 ——的巨噬细胞群（macrophages）巡逻于静脉丛的内表面，并作为“引导细胞”与造血干细胞相互作用，通过一类整合素（Integrin α4），将造血干细胞保留在斑马鱼的尾部静脉毛细血管丛。这一关于新形成的造血干细胞归巢的机制发现， 揭示了巨噬细胞的重要作用。巨噬细胞的这一“引导”造血干细胞的作用还可能类似于巨噬细胞引导“癌细胞“转移的作用。

刘兵（军事医学科学院，研究员、杰青）

造血干细胞起源于中期胚胎背主动脉的生血内皮细胞；产生后即迁移至胎肝大量、快速扩增；在胚胎晚期逐步迁移至骨髓。因此，造血干细胞的胚胎发育经历了剧烈的时空转换，其调控机制也是灵活多样和异常复杂。尤为突出的，关于胚胎微环境的结构特征及如何调节造血干细胞的迁移和归巢，仍有太多谜团亟待解析。

潘巍峻研究员团队近年来致力于应用斑马鱼进行造血干细胞归巢过程及其微环境相关研究。斑马鱼具有产卵量高、周期短及胚体半透明的优势，易于进行活体成像及遗传谱系示踪，近年来已有大量研究聚焦造血干祖细胞的发生，却罕有针对其迁移和归巢的观察。潘巍峻团队利用斑马鱼突变体cas005，结合高分辨率的活体成像技术进行谱系示踪。在对斑马鱼Caudal haematopoietic tissue （CHT）（相当于哺乳动物的胎肝）的造血干祖细胞的归巢进行追踪时，发现VCAM-1+巨噬细胞样群体，像“巡逻兵”一般在静脉丛内表面进行“活动”，以itga4依赖的方式与造血干祖细胞相互作用，作为“usher cells”（引导细胞）调控其在造血微环境中的停留。然而，itga4突变体仅特异性破坏了CHT的造血活动，并未影响胸腺和肾髓的造血功能，表明其归巢的分子机制具有组织特异性。毫无疑问，该研究也将为阐明哺乳动物造血干细胞在发育早期的迁移和归巢提供重要而新颖的启示。

陈良怡（北京大学分子医学研究所，教授）

“Seeing is believing”。本研究的一个特色是应用高分辨率的成像工具，在斑马鱼体内实时观察到HSPC的归巢过程。与传统的免疫荧光成像只能提供少数几个离散时间点图像不同，结合实时成像和光变色追踪可以实时观察活斑马鱼胚胎内不同的HSPC的不同命运，从而得到HSPC细胞归巢过程的整体图像。

具体来说，潘巍峻组从空间上可以观察到HPSC细胞在归巢过程中驻留的“热点区域”，由此信息可以推断这些热点区域可能存在于HPSC细胞相互作用的环境因素有关； 另一方面，在时间上通过分析不同的HSPC在胚胎中的停留时间上可以区分出四类不同事件，进一步推断不同事件可能与HSPC细胞与其归巢信号作用的强弱有关。这些时空信息提供了重要的引导信息，结合之前的工作帮助他们找到血管中巡逻的VCAM-1+巨噬细胞，这种之前没有预料到的“先导细胞”通过与HSPC细胞的在不同位置和不同时间上的相互作用，最后决定了HSPC细胞的命运。

从这个工作中也可以看出来，每个斑马鱼胚胎都是不一样的，即使是同一个斑马鱼胚胎内不同发育阶段不同位置的HSPC细胞的命运也不一样；如果是免疫荧光或者电镜等固定死样本上的成像方法很难观察到所有的信息，很难从这些个体差异中总结出规律，这也凸显了活体成像的优势。最后，这个工作也突出了斑马鱼这种胚胎透明的模式动物的优势，由于可以应用活体成像，加上了时间轴的动态信息，可以揭示其他模式动物很难看清楚的发育基本问题。如果再结合最近很热的深层成像三光子显微镜或是活细胞超高分辨率显微镜，将来也可以将活体成像扩展到成体水平或是精细到亚细胞器水平，将可以揭示更多的基本生命活动过程机制。

参考文献

1, Kissa, K. & Herbomel, P.Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature 464, 112–115 (2010).

2, Bertrand, J. Y. et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature 464,108–111 (2010)

3, Boisset, J. C. et al. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature 464, 116–120 (2010)

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